王露，唐付杰，徐笑非，詹力，王星敏，2

(1.重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，重慶 400067；2.重慶市特色農(nóng)產(chǎn)品加工儲運(yùn)工程技術(shù)研究中心，重慶 400067)

桑葉含有多種生理活性物質(zhì)，具有降血糖[1]、降血脂[2]、抗炎[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤、抗菌抗病毒[5]等多種藥理作用，常作為天然著色劑、抗氧化劑和功能性食品原料[6]，國家衛(wèi)生部將桑葉列為藥食同源的中藥[7]，衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)桑葉提取物作為新食品原料[8]。制備型高效液相色譜法(P-HPLC)是目前最成熟、應(yīng)用最為廣泛的分離純化技術(shù)，具有純度高、產(chǎn)率高、分離速度快等優(yōu)點(diǎn)。目前我國對桑葉開發(fā)利用僅為初加工，多為復(fù)方制劑，而天然活性成分單體的應(yīng)用不多，影響桑葉高附加值的提取物經(jīng)濟(jì)推廣。故開展桑葉高活性成分篩選及開發(fā)有助于提高桑葉綜合利用，滿足廣大人民群眾醫(yī)療健康的需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

桑葉，重慶市農(nóng)科院；無水乙醇、磷酸均為分析純；乙腈、甲醇均為色譜純；異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)。

1260高效液相色譜儀；CJF-0.05小型高壓反應(yīng)釜；DHG-9070A臺式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵；KC-100高速粉碎機(jī)；IR Prestige-21傅里葉變換紅外光譜儀；KQ-250V超聲波清洗機(jī)；Gelailnest半制備色譜儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桑葉粗提液的制備 分別稱取過篩的干燥桑葉5 g于水熱反應(yīng)釜內(nèi)膽中，按乙醇體積與桑葉質(zhì)量比為7∶1 mL/g加入體積分?jǐn)?shù)為57%的乙醇，于154 ℃的烘箱中水熱反應(yīng)80 min后，過濾，分別收集濾渣和濾液，濾液即含有異槲皮苷醇提液；濾渣集中收集后以待二次利用。

1.2.2 活性成分檢測及分析 用分析型高效液相色譜分析。色譜柱為Hypersil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相是體積比20∶80的乙腈和0.5%磷酸水溶液，流速為1 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL；通過對樣品進(jìn)行分析型液相色譜全掃描，確定異槲皮苷的最大吸收波長為350 nm。

1.2.3 活性成分分離純化 半制備型液相色譜條件為色譜柱(C18-8)，流動(dòng)相為乙腈-水(20∶80)；進(jìn)樣量10 mL，流速20 mL/min；檢測波長350 nm。按照上述方法進(jìn)Gelailnest制備色譜儀，根據(jù)樣品的保留時(shí)間進(jìn)行分段收集，得到4種餾分A、B、C、D。并按照式(1)計(jì)算分離度。

(1)

其中，tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間；tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間；W1、W2為此相鄰兩峰的峰寬?！吨袊幍洹芬?guī)定：R≥1.5，視為完全分離；R<1，部分重疊。通常R=1.5可作為已完全分離的標(biāo)志。

1.2.4 單體制備 采用冷凍干燥法將收集的 4種餾分和桑葉粗提液分別進(jìn)行干燥，得到A、B、C、D和提取復(fù)合物的粉末狀固體物，稱其質(zhì)量記為WA、WB、WC、WD和W1。分別準(zhǔn)確稱取2 mg，用57%的乙醇溶解，定容于25 mL容量瓶中，采用高效液相色譜分析方法進(jìn)行純度測定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度C，則制備率的計(jì)算公式如下：

(2)

式中C——粗提液中各成分的濃度，mg/mL；

V——粗提液的體積，mL；

W——制備得到的各單體的量，mg。

1.2.5 產(chǎn)品紅外分析 采用衰減全反射模式測定制備得到的4種成分的傅里葉變換紅外光譜，分析制備得到的粉末的表面官能團(tuán)，測定波數(shù)為4 000～500 cm-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離純化適宜條件篩選

2.1.1 流動(dòng)相體系及配比的選擇 當(dāng)流速為20 mL/min，進(jìn)樣量為10 mL，分別考察了不同比例的甲醇-水和乙腈-水為流動(dòng)相對異槲皮苷分離效果的影響，結(jié)果見表1。

表1 不同流動(dòng)相體系及配比對異槲皮苷分離效果的影響

由表1可知，隨著溶劑極性的減小，異槲皮苷的保留時(shí)間、分離度及異槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸減小。當(dāng)甲醇的比例低于30%時(shí)，流動(dòng)相洗脫能力不強(qiáng)，異槲皮苷不能和其它活性成分很好的分離，并且拖尾嚴(yán)重，導(dǎo)致異槲皮苷收集不完全，從而使得產(chǎn)品的純度較低；當(dāng)甲醇比例大于50%時(shí)，雖能在較短時(shí)間得到組分，但由于洗脫能力過強(qiáng)，使得異槲皮苷與其他成分無法分離[9]，純度低。而當(dāng)流動(dòng)相為V乙腈∶V水=20∶80時(shí)，分離度為1.74，分離效果好，其純度為98.13%。與甲醇體系洗脫比較，異槲皮苷在甲醇體系中靠近異槲皮苷的其它活性成分為黃酮類物質(zhì)，故比較難分開，而乙腈則有一定的手性拆分能力[10]，所以乙腈體系可以得到較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的異槲皮苷及其它成分。

2.1.2 流速對異槲皮苷分離效果的影響 當(dāng)V乙腈∶V水=20∶80，進(jìn)樣量為10 mL時(shí)，分別考察了流速為15，20，25 mL/min異槲皮苷分離效果的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 流速對異槲皮苷分離效果的影響

由圖1可知，隨著流速的增大，異槲皮苷的保留時(shí)間減少，分離度降低，樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)減小。較低的流速一般峰高較高，分離度也較大，但流速低，洗脫時(shí)間延長[11]。若以15 mL/min洗脫時(shí)，樣品的保留時(shí)間較長，流動(dòng)相用量多，蒸餾費(fèi)時(shí)。而以25 mL/min洗脫時(shí)，流速增加，因固定相內(nèi)擴(kuò)散阻力起控制作用，溶質(zhì)組分在固定相和流動(dòng)相兩相之間的分配偏離分配平衡的幅度增加，分離度降低，色譜峰擴(kuò)展加劇，因而溶質(zhì)稀釋程度增加，流動(dòng)相消耗增大，同時(shí)也增加了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[12]。綜合各種因素，實(shí)驗(yàn)選擇20 mL/min的流速進(jìn)行考察。

2.1.3 粗提液不同進(jìn)樣量對異槲皮苷分離效果的影響 當(dāng)V乙腈∶V水=20∶80，流速為20 mL/min時(shí)，考察了進(jìn)樣量分別為5，8，10 mL對異槲皮苷分離效果的影響，結(jié)果見圖2。通過增加進(jìn)樣量可以提高制備率[13]，但分離度卻隨著進(jìn)樣量的增加呈現(xiàn)下降趨勢。

圖2 進(jìn)樣量對異槲皮苷分離效果的影響

由圖2可知，異槲皮苷的分離度隨著進(jìn)樣量增大而降低，但是仍然大于1.5，可視為完全分離，異槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.78%，在保證純度的情況下，盡量增加樣品處理量，提高制備率，因此，進(jìn)樣量為10 mL 最為合適。

2.2 產(chǎn)品檢測與分析

2.2.1 制備單體的HPLC定性分析 將1.2.4節(jié)配制好的制備單體溶液按HPLC分析條件進(jìn)樣分析，與標(biāo)品溶液出峰時(shí)間進(jìn)行對照，具體情況見表2，可以確定A、B、C、D 分別是綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷。因此，通過單次PHPLC分離除了可以得到異槲皮苷，還可得到綠原酸、蘆丁和紫云英苷3種活性物質(zhì)，整個(gè)過程用時(shí)較短、毒性低、分離效果較好，可連續(xù)進(jìn)樣制備，桑葉提取液的半制備液相色譜圖出峰情況見圖3。

表2 制備單體溶液與標(biāo)品溶液高效液相出峰時(shí)間對照表

圖3 粗提物溶液的半制備液相色譜圖

2.2.2 制備單體的紅外分析 通過測定制備單體的紅外光譜，結(jié)果見圖4。

圖4 紅外光譜圖Fig.4 The infrared spectrogram

2.3 制備率計(jì)算及效益分析

2.3.1 制備單體的制備率計(jì)算 合并多次粗提液共500 mL，其中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷的濃度分別為0.501 8，0.157 8，0.369 4，0.068 mg/mL，可得出500 mL溶液中含有的綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷的量分別是250.9，78.9，182.45，34 mg。將500 mL粗體液濃縮至20 mL后，半制備色譜連續(xù)進(jìn)樣2次，收集合并相應(yīng)餾分，經(jīng)冷凍干燥后稱其質(zhì)量W，按照式(2)計(jì)算各組分的得率，結(jié)果見表3。

表3 制備單體的制備率

2.3.2 效益分析 除了目標(biāo)產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、產(chǎn)量、消耗時(shí)間，成本也是PHPLC的主要考慮因素。市面上，乙腈(色譜純)售價(jià)360元/4 L，即乙腈為0.09元/mL，按照V乙腈∶V水=20∶80為流動(dòng)相20 mL/min為流速時(shí)，單次制備需要耗時(shí)40 min，乙腈的用量是160 mL，即消耗的流動(dòng)相的成本為14.4元/次。國內(nèi)市場上含量≥98%的異槲皮苷售價(jià)為1 000元/20 mg，含量≥98%的綠原酸售價(jià)為139元/20 mg，含量≥98%的蘆丁售價(jià)為140元/20 mg，含量≥98%的紫云英苷售價(jià)為500元/20 mg。本次實(shí)驗(yàn)所得到的4種產(chǎn)品的質(zhì)量根據(jù)市面價(jià)格折算，預(yù)計(jì)收益約3 091元。

3 結(jié)論

(1)乙腈作為流動(dòng)相分離效果較甲醇更好，最終適宜的分離純化條件為：V乙腈∶V水=20∶80，進(jìn)樣量10 mL，流速20 mL/min。

(2)通過單次PHPLC分離除了可以得到異槲皮苷，還可得到綠原酸、蘆丁和紫云英苷3種活性物質(zhì)，純度均≥98%，制備率分別為26.36%，30.37%，19.51%，11.47%。

(3)每進(jìn)樣制備一次所消耗的乙腈成本為14.4元 ，本實(shí)驗(yàn)制備單體的量按照市面標(biāo)準(zhǔn)品的價(jià)格來折算，效益預(yù)測約為3 091元。