馮永巍，汪振炯

（1.無(wú)錫市食品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇無(wú)錫214100；2.南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，江蘇南京211171）

利用相對(duì)廉價(jià)的豬肉冒充牛羊肉的現(xiàn)象近年來(lái)偶有發(fā)生，不僅破壞了市場(chǎng)公平，而且也成為威脅食品安全的重要隱患[1]。為了有效識(shí)別肉類摻假行為，建立一套高效、準(zhǔn)確摻假鑒別方法，從肉制品中識(shí)別出豬源性成分是十分必要的。國(guó)內(nèi)外的研究以豬肉蛋白、豬DNA 為檢測(cè)指標(biāo)建立了一些豬源性成分的檢驗(yàn)方法[2-15]。其中以（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)為代表的核酸檢測(cè)技術(shù)以其檢測(cè)的準(zhǔn)確性高，靈敏度高，抗干擾強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)得到了研究人員的廣泛接受[16-21]，但也存在設(shè)備昂貴、操作繁瑣、對(duì)操作人員要求高等缺點(diǎn)，推廣和應(yīng)用仍存在一定的局限性。

基于膠體金的可視化檢測(cè)為豬源性成分摻假鑒定提供了一個(gè)嶄新的技術(shù)平臺(tái)。膠體金粒子具有高電子密度的特性，當(dāng)與膠體金顆粒結(jié)合的大分子在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，會(huì)形成肉眼可見的紅色或者粉紅色斑點(diǎn)。膠體金試紙條將各種反應(yīng)試劑以條帶固定在試紙條上，樣本溶液從試紙條的一端通過(guò)毛細(xì)管作用向另一端移動(dòng)，樣品中的待測(cè)物同層析材料上針對(duì)待測(cè)物的受體發(fā)生特異性反應(yīng)。結(jié)合膠體金的待測(cè)樣本被截留、聚集在層析材料的一定區(qū)域，通過(guò)目測(cè)可直觀得到顯色[22-25]。本研究利用膠體金試紙條的原理，通過(guò)共價(jià)修飾有豬特異性核酸序列的膠體金顆粒與硝酸纖維素（nitrocellulose filter，NC）膜上固定的生物素修飾的互補(bǔ)核酸序列相互作用，開發(fā)快速檢測(cè)豬肉成分的試紙條及檢測(cè)方法，為肉類種源成分快速鑒定技術(shù)的研發(fā)，進(jìn)行有益的探索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

紫外可見分光光度計(jì)（UV-2600）：日本島津公司；透射電鏡（H7000）：日本日立公司；電磁攪拌加熱器（C-MAG HS7）：德國(guó)IKA 公司；微量移液器（F-10）：德國(guó)BRAND 公司。

1.2 試驗(yàn)材料

氯金酸，檸檬酸三鈉，氯化鈉，乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA），十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS），三羥甲基氨基甲烷（2-Amino-2-（hydroxymethyl）-1，3-propanediol，Tris），鹽酸等（以上均為分析純）；蛋白酶K（Proteinase K）：購(gòu)于sigma 公司。

1.3 豬特異性核酸探針的選擇

根據(jù)Genebank 公布的豬線粒體基因的保守序列（GenBank：AF039170.1），選擇了“CAA CTA GAT ACA TCT ACA TGA TTC ATT AC”這一能代表豬種屬的特異性序列片段，片段長(zhǎng)度為29 bp，約10 nm。該片段修飾巰基得到可以與膠體金粒子共價(jià)結(jié)合的探針A，以及將該序列的互補(bǔ)片段修飾生物素，得到可以固定在NC 膜上的探針B，探針序列見表1。

表1 探針序列Table 1 Sequences of probes

1.4 膠體金溶液的制備

取濃度0.01%氯金酸溶液100 mL，攪拌（100 r/min）加熱至沸騰并持續(xù)2 min，逐滴加入1%檸檬酸三鈉溶液2 mL，繼續(xù)攪拌加熱6 min，直至溶液呈透亮的酒紅色。冷卻至25 ℃，裝入分子量12 000 MW 的透析袋透析2 d，得到濃度約為3 nmol/L 膠體金溶液。在透射電鏡下觀察溶液中膠體金粒子的大小是否均勻一致，有無(wú)橢圓形及多角形金粒子存在，并測(cè)量金粒子直徑。

1.5 核酸探針與膠體金的偶聯(lián)

取1 mL 制備好的膠體金溶液，分別加入不同體積的0.1 mmol/L 的豬特異性核酸探針A，37 ℃水浴中溫育12 h，得到膠體金-探針A 復(fù)合物[26]。再分別加入100 μL 濃度為10%的NaCl 溶液，觀察各管的顏色變化，篩選最佳DNA 用量，探針A 的添加量見表2。

表2 核酸探針A 與膠體金偶聯(lián)試驗(yàn)方案Table 2 Scheme of coupling of probe A and colloidal gold particles

1.6 樣品DNA 提取

稱取剪碎的熟肉樣品100 mg，置于1.5 mL EP 管中，加入1 mL 組織裂解液[10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）]，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，0.5 % SDS，0.4 mg/mL proteinase K），將EP 管置于沸水中煮15 min，然后5 000 r/min 離心10 min，吸取上清。將提取的DNA 樣品進(jìn)行紫外檢測(cè)，確認(rèn)A260/A280的數(shù)值在1.8~1.9 左右，并用超純水調(diào)節(jié)DNA 濃度，使其A260=1，此時(shí)DNA 濃度約0.1 mmol/L。

1.7 試紙的組裝與測(cè)試

將不同濃度的探針B 噴在硝酸纖維素膜中間位置，噴涂量為30 μL。37 ℃干燥2 h 后貼在黏性塑料背板上，并在上下兩端分別貼上玻璃纖維膜和吸收濾紙，裁切成3 mm 寬度，即為檢測(cè)試紙。取30 μL 金標(biāo)探針A 溶液分別與系列濃度探針B 的試紙按照表3的方案進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)顯色強(qiáng)度篩選探針B 的最佳濃度，探針B 的濃度如表3 所示。

表3 探針B 最低濃度試驗(yàn)方案Table 3 Concentration gradient scheme of probe B

1.8 檢測(cè)方法的實(shí)施

試紙的檢測(cè)過(guò)程見圖1。

圖1 豬源性成分快速比色檢測(cè)原理Fig.1 The schematic of development of a colloidal gold lateral flow strip assay for pork identification

吸取提取的DNA 樣品30 μL，加至100 μL 金標(biāo)探針A 體系中混勻，37 ℃溫育5 min。將試紙條的玻璃纖維膜一端插入反應(yīng)體系，探針溶液在毛細(xì)作用下，開始向試紙條上端流動(dòng)，等待3 min，判斷顯色情況。如樣品中不含豬肉DNA，則修飾有膠體金米粒子的探針A 會(huì)與硝酸纖維素膜上的互補(bǔ)序列進(jìn)行特異性結(jié)合，大量金粒子堆積在探針B 處，出現(xiàn)紅色可見條帶；反之樣品中含有豬肉DNA 時(shí)，則該DNA 會(huì)優(yōu)先與膠體金粒子表面的探針A 特異性結(jié)合，形成雙鏈DNA 結(jié)構(gòu)，膠體金粒子探針就不會(huì)再與試紙條上的互補(bǔ)DNA發(fā)生結(jié)合，此時(shí)硝酸纖維素膜上就不會(huì)出現(xiàn)可見條帶，說(shuō)明檢測(cè)的樣品中含有豬肉DNA。

1.9 檢出限

取適量純牛肉，分別添加0%、2%、5%、10%、20%的豬肉，混合攪碎，按照1.7 的方法進(jìn)行檢測(cè)，觀察試紙條檢測(cè)結(jié)果，確定最低檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金溶液的表征

采用檸檬酸三鈉還原法制備了膠體金溶液，溶液呈酒紅色。溶液的透射電鏡結(jié)果見圖2。

圖2 膠體金粒子的透射電鏡圖Fig.2 TEM image of colloidal gold particles

如圖2 所示，在透射電鏡下觀察到金粒子的大小基本一致，分散性比較好，無(wú)多角形的金粒子，也沒有聚集現(xiàn)象。通過(guò)隨機(jī)挑選電鏡照片上10 個(gè)金顆粒，測(cè)量其平均直徑大小在30 nm 左右。通常膠體金試紙的金粒子直徑在10 nm～40 nm，試紙檢測(cè)的信號(hào)是由于金粒子聚集而產(chǎn)生的，金粒子太小就不能產(chǎn)生足夠的顏色信號(hào)差異。在本研究中金粒子表面要修飾巰基，因此在制備過(guò)程中控制膠體金粒子直徑約為30 nm 左右。

2.2 特異性核酸探針選擇

為了得到特異性檢測(cè)結(jié)果，從GenBank 公布的豬線粒體基因保守序列（GenBank：AF039170.1）中選擇核酸片段作為檢測(cè)目標(biāo)探針。探針A 通過(guò)巰基與膠體金粒子表面形成的金-硫鍵結(jié)合在一起，金-硫鍵的結(jié)合比較牢固，能保證膠體金-探針復(fù)合物在試紙條上運(yùn)動(dòng)的過(guò)程中保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。探針B 生物素偶聯(lián)使得整體分子量變大，從而利用疏水鍵作用固定在NC 膜上。在檢測(cè)過(guò)程探針B 通過(guò)特異性結(jié)合對(duì)探針A 進(jìn)行截留，最終金粒子-探針A 復(fù)合物在探針B 處聚集顯色。核酸探針的長(zhǎng)度對(duì)檢測(cè)方法的特異性和靈敏度有較大影響，探針過(guò)短既不利于對(duì)金粒子的保護(hù)，也不利于互補(bǔ)反應(yīng)的發(fā)生。而過(guò)長(zhǎng)的序列則會(huì)增加反應(yīng)的空間位阻從而降低檢測(cè)靈敏度。本研究最終選擇的片段長(zhǎng)度為29 bp，約10 nm。

2.3 核酸與膠體金偶聯(lián)的最佳量

膠體金粒子在試紙上的聚集依靠DNA 的互補(bǔ)結(jié)合，偶聯(lián)的核酸越多反應(yīng)越容易發(fā)生，但過(guò)多的核酸又會(huì)增加反應(yīng)的空間位阻導(dǎo)。本研究通過(guò)核酸在鹽溶液中對(duì)膠體金的保護(hù)試驗(yàn)確定核酸的最適合用量。核酸探針A 與膠體金偶聯(lián)的目測(cè)結(jié)果見表4。

從表4 可以看出，1 管~4 管由于偶聯(lián)核酸的量不足，不能穩(wěn)定膠體金，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象。從第5 管開始，膠體金的顏色基本一致，說(shuō)明偶聯(lián)的核酸量達(dá)到或超過(guò)了穩(wěn)定膠體金的最低量。因此最適DNA 用量為在第5 管（50 μL）基礎(chǔ)上再增加20%，即為實(shí)際核酸用量為60 μL。

表4 目測(cè)法確定最適用量Table 4 Optimum amount of probe A labeled with colloidal gold by visual inspection

2.4 探針B 噴涂的最適濃度

檢測(cè)試紙采用的是競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)原理，即待測(cè)樣品與探針B 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合探針A，通過(guò)顯色差異判定結(jié)果。既要求探針A 和探針B 結(jié)合顯色清晰，且探針的量又不能太高，探針量的增加意味著需要更多的樣品量，方法的檢出限也隨之升高。探針B 最低噴涂濃度篩選的結(jié)果見表5。

表5 探針B 噴涂量的篩選Table 5 Screening of the concentration of probe B

從表5 可知，當(dāng)序列B 核酸濃度達(dá)到7.5 nmol/L時(shí)開始有明顯顯色，選定這一濃度作為探針B 的最適噴涂濃度。

2.5 檢出限

提取得到的DNA 樣品需要首先進(jìn)行濃度鑒定，并調(diào)節(jié)DNA 濃度至0.1 mmol/L 左右，使得在檢測(cè)過(guò)程中樣本DNA 含量相對(duì)于探針A 是過(guò)量的，確保探針A全部被反應(yīng)掉，檢測(cè)方法有最佳的敏感度。分別測(cè)定了含有0%、2%、5%、10%、20%豬肉成分的樣品，檢測(cè)結(jié)果見表6。

表6 豬肉檢測(cè)試紙條檢測(cè)結(jié)果Table 6 Visual result of test strip for pork identification

當(dāng)樣品中不含有豬肉成分時(shí)，檢測(cè)線處的紅色條帶清晰可見。隨著樣品中豬肉含量的提高，檢測(cè)線處的條帶顏色隨之變淺。當(dāng)豬肉含量達(dá)到5%時(shí)，測(cè)試線顯色與背景之間的反差已不明顯，且各平行樣品之間略有差異。當(dāng)豬肉含量達(dá)到10%以上時(shí)，檢測(cè)線處已無(wú)明顯的肉眼可辨別的顯色。一般來(lái)講，肉類摻假以牟利為目的，摻假量通常都比較高，過(guò)低的檢出限在應(yīng)用實(shí)踐中意義不大。本研究采用肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果，不同測(cè)試者對(duì)臨界結(jié)果的判斷會(huì)有較大差異，因此選擇豬肉含量10%作為方法的檢出限。

3 結(jié)論

本文利用共價(jià)修飾有豬特異性核酸序列的膠體金顆粒與硝酸纖維素（NC）膜上固定的生物素修飾的互補(bǔ)核酸序列相互作用，開發(fā)了一種用于鑒別豬肉成分的膠體金試紙條及快速檢測(cè)方法，研究結(jié)果表明探針A 與膠體金偶聯(lián)的最佳用量為60 μL（0.1 mmol/L），探針B 噴涂的最佳濃度是7.5 nmol/L，試紙條的檢出限為10%。該方法簡(jiǎn)單有效，有著較好的應(yīng)用前景。