龐永豐，羅楊合，2，吳鳳蓮，2，伍淑婕，聶輝，段振華，2，黎小椿，*

（1.賀州學院食品科學與工程技術研究院，廣西賀州542899；2.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧大連116034）

鉛是一種對人體有害的重金屬元素。當鉛在人體的累積量超過一定量時，就會對人體造成嚴重損害。同時鉛會損害兒童神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，進而會導致其智能指數(shù)下降10 分~20 分[1]。通過調(diào)查研究了解到，目前部分耕地受到了重金屬的污染[2]。因此，對重金屬的檢測和預防，并運用一些科學、靈敏、穩(wěn)定、簡便和快速的檢測方法對重金屬進行定量檢測，具有重要的研究意義。

目前，常用于對樣品中重金屬鉛的檢測方法分別為：原子熒光法[3]、原子吸收分光光度法[4]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[5]、激光誘導擊穿光譜法[6]、雙硫腙比色法[7]以及表面增強拉曼散射光譜法（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）[8]。其中，原子熒光法的優(yōu)點是檢出限相對較低，靈敏度較高，共存物質(zhì)的干擾較小，對重金屬檢測的線性范圍較寬，可以同時對多種元素進行檢測；缺點是在對樣品檢測過程中，會產(chǎn)生熒光淬滅效應以及散射光等問題的干擾。原子吸收分光光度法的優(yōu)點是選擇性高，干擾少，靈敏度高，準確度高；缺點是不能對多元素同時分析，對難熔元素測定的靈敏度不高。電感耦合等離子體質(zhì)譜法的優(yōu)點是對樣品中的物質(zhì)測定較為準確、快速，且靈敏度較高，共存物質(zhì)的干擾較?。蝗秉c是對于電離電位高的元素靈敏度低。激光誘導擊穿光譜法的優(yōu)點是可以遠程和實時對元素進行在線檢測，并且可以進行多元素同時檢測；缺點是檢測較慢，不能對元素進行準確的定量分析。雙硫腙比色法優(yōu)點是操作簡便、快速和穩(wěn)定性好；缺點是雙硫腙的添加量不易控制，造成誤差較大。與上述其它方法相比較，SERS 法具有操作簡便、檢測快速、靈敏度高、分析準確等優(yōu)點，是一種理想的重金屬檢測新方法。Mark S.Frost 等[9]成功地證明了SERS方法是一種檢測在水介質(zhì)中Pb2+的高靈敏度方法。試驗結果表明，SERS 具有高靈敏度（LOD25 ng/L），在很寬的線性范圍內(nèi)（25 ng/L~1 000 ng/L）Pb2+離子可以準確地被檢測出來。所以建立精確SERS 法定量分析重金屬鉛具有重要研究意義。

SERS 法常被用于重金屬離子的分析與檢測[10-12]。其主要原因是SERS 技術可以提供化學和生物分子結構方面的指紋信息，同時也可以對痕量物質(zhì)進行檢測。近年來，基于DNA 酶裂解反應SERS 法檢測分析物非常受研究人員的關注，因為其可以用于提高對物質(zhì)檢測的靈敏度、選擇性以及檢測速度[13-15]。Wang 等[16]通過試驗探究，建立了一種測定Pb2+的DNA 酶傳感器SERS 探針的新方法，其原理是當體系中加入Pb2+后，Pb2+可切割DNA 的底物鏈使得納米金共軛物與金基底分離，使得拉曼信號變?nèi)?。且在一定Pb2+的濃度范圍內(nèi)，Pb2+的濃度與SERS 信號強度的變化，呈現(xiàn)良好的線性關系，從而可對Pb2+進行痕量分析檢測。但目前對于Pb2+的SERS 定量分析方法相對較少，基于DNA 酶裂解反應與銀納米粒子、羅丹明6G（rhodamine 6G，Rh6G）結合并應用于對重金屬Pb2+的SERS 定量檢測分析方法尚未見報道。

研究發(fā)現(xiàn)，將SERS 與適配體和DNA 酶相結合，有助于對痕量物質(zhì)更好地進行檢測分析。因此，本文以性質(zhì)穩(wěn)定的液相銀納米溶膠為基底，建立痕量重金屬鉛離子的DNA 酶SERS 定量分析新技術，并用于皮蛋中痕量重金屬鉛離子的檢測分析，既具有科學的理論技術創(chuàng)新，同時又具有良好的應用前景。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

633 nm DXR smart 智能拉曼光譜儀：美國賽默飛世爾公司，激光為633 nm，功率為3.0 mW，采集時間為10 s；MR Hei-Tec 加熱型磁力攪拌器：德祥科技有限公司；Evolution300 型紫外可見分光光度計：美國熱電（上海）科技儀器有限公司；F-4600 熒光分光光度計：日立高新技術公司；WX-8000 微波消解儀：上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；XMTD-8222 恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；1524R 高速離心機：珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司；掃描電鏡（scanning electronic microscope，SEM）：日本日立公司。

1.2 主要試劑

AgNO3（分析純）：廣東光華科技股份有限公司；NaBH4（分析純）：天津市光復精細化工研究所；NaCl（分析純）/HCl（36%~38%）/10 g/L 檸檬酸三鈉：汕頭西隴化工廠有限公司；5.23×10-5mol/L 羅丹明6G（Rh6G）：美國MERCK 公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（disodium ethylenediamine tetraacetic acid，EDTANa2）：成都市科龍化工試劑廠。

混合溶液：依次加入3.72 mL 0.2 mol/L EDTANa2、5 mL 2 mol/L NaCl、0.5 mL 0.2 mol/L Tris，混勻后定容到16 mL，以EDTANa2計算其濃度為4.65×10-2mol/L。

pH 7.2 的Tris-HCl 緩沖液：依次加入5.0 mL 0.2 mol/L Tris、9.0 mL 0.1 mol/L HCl，混合均勻后定容到20 mL。

1.3 雙鏈DNA（dsDNA）的制備

在15 mL 的比色管中，依次加入0.5 mL 0.144 μmol/L的ssDNA、0.5 mL 0.144 μmol/L 的Taq 酶、360 μL 2 mol/L的NaCl、1.45 mL pH 7.2 的Tris-HCl、5.19 mL 的超純水，混勻后于80 ℃水浴鍋中水浴加熱15 min。水浴完畢取出，將其自然冷卻1.5 h，然后保存于4 ℃冰箱。

1.4 銀納米粒子溶液制備

量取40.0 mL 超純水于100 mL 錐形瓶中，用磁力攪拌器攪拌（500 r/min），依次加入3.5 mL 10 g/L 檸檬酸三鈉溶液和0.385 mL 2.4×10-2mol/L AgNO3，攪拌混勻后，逐滴緩慢滴加4.0 mL 0.5 g/L NaBH4，溶液顏色從淺黃色→深黃色→黃色，繼續(xù)攪拌反應15 min 后，定容于50 mL 棕色容量瓶，得到19.9 mg/L 銀納米粒子（AgNPs）溶液，于4 ℃冰箱保存。

1.5 皮蛋消解液的制備

微波消解皮蛋：稱量1.242 0 g 的皮蛋加入到微波消解罐中，然后依次加入5 mL 的濃硝酸和2 mL 30%的過氧化氫，將微波消解儀的溫度設定為100 ℃，壓力分別為3、6、9atm，微波功率分別為1000、1000、2000W。加熱時間分別設定為5、7、5 min，進行微波消解，然后進行加熱趕酸，再將加熱后的溶液定容到25 mL 棕色容量瓶中。量取2 mL 皮蛋微波消解液，進行高速離心，取上清液，過濾，然后取1 mL 皮蛋消解濾液樣品稀釋20 倍，得2.484 mg/mL 皮蛋消解液。

1.6 試驗方法

在5 mL 刻度試管中，依次加入120 μL 9 nmol/L dsDNA 溶液，一定量的Pb2+溶液，混勻25 ℃下靜置8 min后加入10 μL 4.65×10-2mol/L 混合溶液，混勻后加入400 μL 19.9 mg/L 銀納米粒子溶液，搖勻后加入70 μL 5.23×10-5mol/L 的Rh6G 溶液，定容至2.0 mL。取反應液于石英皿中，然后將其過測定613 cm-1處的SERS峰強度I，不加Pb2+做空白為I0，計算ΔI=I-I0。

1.7 試驗原理

在pH 7.2 的Tris-HCl 緩沖液和0.09 mol/L NaCl介質(zhì)中，單鏈DNA（ssDNA）和DNA 酶在80 ℃條件下，雜交成雙鏈DNA（dsDNA）。在dsDNA 和混合溶液存在下，AgNPs 發(fā)生聚集，聚集的AgNPs 與Rh6G 相互作用，在613 cm-1處出現(xiàn)較強的SERS 特征峰。Pb2+可將dsDNA 裂解切割，釋放出ssDNA，形成比表面積和粗糙度均增大的AgNPs-ssDNA-Pb2+大分子締合物。隨著Pb2+濃度的增大，釋放出的ssDNA 增多，形成的Ag－NPs-ssDNA-Pb2+增多，AgNPs-ssDNA-Pb2+與Rh6G 作用增強，導致613 cm-1處的SERS 峰強度增大。

2 結果與討論

2.1 SERS 光譜

Pb2+-dsDNA-AgNPs 體系的SERS 光譜見圖1。

圖1 Pb2+-dsDNA-AgNPs 體系的SERS 光譜Fig.1 Raman scattering Spectra of Pb2+-dsDNA-AgNPs system

當無Pb2+存在時，dsDNA 不能保護AgNPs 在混合溶液存在下發(fā)生聚集，聚集的AgNPs 與Rh6G 結合較弱，在613 cm-1拉曼位移處出現(xiàn)SERS 特征峰。當加入Pb2+，形成比表面積和粗糙度均增大的AgNPs-ssDNAPb2+大分子締合物，AgNPs-ssDNA-Pb2+與Rh6G 結合，在613 cm-1處有較強的SERS 峰。隨著Pb2+濃度的增大，613cm-1處的SERS 峰線性增強，故本文選擇613 cm-1處進行測定，結果見圖2。

圖2 Pb2+-dsDNA-AgNPs 體系的SERS 光譜Fig.2 Raman scattering Spectra of Pb2+-dsDNA-AgNPs system

2.2 吸收光譜

紫外-可見吸收測納米銀圖見圖3，Pb2+-dsDNAAgNPs 體系的吸收光譜圖見圖4。

圖3 紫外-可見吸收測納米銀圖Fig.3 Ultraviolet absorption determination of silver nanoparticle

圖4 Pb2+-dsDNA-AgNPs 體系的吸收光譜圖Fig.4 Absorption spectra of Pb2+-dsDNA-AgNPs system

球形AgNPs 溶膠呈黃色，由圖3 可知其吸收峰主要在394 nm。AgNPs 溶膠聚集后呈灰藍色，Rh6G 溶液呈橙紅色，圖4 中530 nm 處的吸收峰是AgNPs 聚集體與Rh6G 作用的結果。在Pb2+存在的條件下，Pb2+可裂解切割dsDNA，釋放ssDNA，形成比表面積和粗糙度均增大的高褶皺度葉子狀AgNPs-ssDNA-Pb2+大分子締合物。隨著Pb2+濃度增加，形成的AgNPs-ssDNAPb2+締合物增多，AgNPs 聚集體減少，AgNPs-ssDNAPb2+與Rh6G 作用增強，體系中AgNPs 聚集體的灰藍色減少而Rh6G 的橙紅色增強，故530 nm 的吸收峰增強。此結果與SERS 光譜一致。

2.3 共振散射光譜

Pb2+-dsDNA-AgNPs 體系的共振散射光譜如圖5所示。

圖5 Pb2+-dsDNA-AgNPs 體系的共振散射光譜圖Fig.5 Resonance scattering spectra of Pb2+-dsDNA-AgNPs system

在dsDNA 和混合溶液存在下，AgNPs 發(fā)生聚集，在545 nm 處有一個較強的共振散射光譜峰。當加入Pb2+后，Pb2+可裂解切割dsDNA，釋放ssDNA，ssDNA 吸附在AgNPs 表面，形成比表面積和粗糙度均增大的高褶皺度葉子狀AgNPs-ssDNA-Pb2+大分子締合物，Ag－NPs 聚集體減少，導致545 nm 處的共振散射峰強度降低。其共振散射值隨Pb2+的加入量增大而降低。此結果與SERS 光譜一致。

2.4 SEM 表征

掃描電鏡圖見圖6。

通過掃描電鏡（SEM）結果表明所制備的AgNPs形狀是球形，其平均尺寸約為90 nm（圖6a）。在0.54 nmol/L dsDNA-3.98 mg/L AgNPs-2.325×10-4mol/L混合溶液的存在下，AgNPs 顆粒聚集（圖6b）。當加入Pb2+后，Pb2+可裂解切割dsDNA，釋放出ssDNA，ssDNA吸附在AgNPs 表面，形成比表面積和粗糙度均增大的高褶皺度葉子狀AgNPs-ssDNA-Pb2+大分子締合物（圖6c）。AgNPs-ssDNA-Pb2+大分子締合物具有高SERS 活性，這與試驗分析原理一致。

圖6 測銀納米的掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscopy of silver nanoparticles

2.5 Pb2+-dsDNA-AgNPs 體系的條件優(yōu)化

2.5.1 AgNPs 濃度的影響

銀納米粒子濃度的影響見圖7。

圖7 銀納米粒子濃度的影響Fig.7 Effects of concentration of silver nanoparticles

探討AgNPs 濃度對Pb2+-dsDNA-AgNPs 體系的影響，當體系中沒有加入AgNPs 時，SERS 信號很弱，幾乎為0。當AgNPs 的加入量逐漸增大時，SERS 信號的變化值ΔI 也在逐漸增大。當AgNPs 的濃度為3.98 mg/L時，ΔI 達到最大值，故選擇AgNPs 的濃度為3.98 mg/L。

2.5.2 混合溶液濃度的影響

圖8 混合溶液的影響Fig.8 Effects of mixed solution

混合溶液的影響見圖8。如圖8 所示，以AgNPs 為基底，當體系中沒有加入混合溶液時，SERS 信號的變化量ΔI 較弱。當混合溶液的加入量逐漸增大時，SERS信號的變化值ΔI 也在逐漸增大。當混合溶液的濃度為2.325×10-4mol/L 時，ΔI 達到最大值，由于隨著混合溶液濃度的增大，所含的氯化鈉濃度也隨之增大，Ag－NPs 顆粒聚集過大，導致ΔI 值逐漸減小，故選擇混合溶液的濃度為2.325×10-4mol/L。

2.5.3 dsDNA 濃度的影響

探討dsDNA 濃度對Pb2+-dsDNA-AgNPs 體系的影響結果見圖9。

圖9 dsDNA 濃度的影響Fig.9 Effects of dsDNA concentration

AgNPs 為基底，當體系中沒有加入dsDNA 時，SERS 信號很弱。當dsDNA 的加入量逐漸增大時，SERS 信號的變化值ΔI 也在逐漸增大。當dsDNA 的濃度為0.54 nmol/L 時，ΔI 達到最大值，故選擇dsDNA 的濃度為0.54 nmol/L。

2.5.4 Rh6G 濃度的影響

探討Rh6G 濃度對Pb2+-dsDNA-AgNPs 體系的影響，結果見圖10。以AgNPs 為基底，當體系中沒有加入Rh6G 時，SERS 信號很弱，幾乎為0。隨著Rh6G 濃度不斷增大，SERS 信號的變化量ΔI 不斷增大。當Rh6G的濃度為1.830 5×10-6mol/L 時，ΔI 達到最大值，因此選擇Rh6G 的濃度為1.830 5×10-6mol/L。

圖10 Rh6G 濃度的影響Fig.10 Effects of Rh6G concentration

2.5.5 加樣順序?qū)yPb2+體系的影響

探討加樣順序Pb2+-dsDNA-AgNPs 體系的影響，結果見圖11。

由圖11 可知，當加樣順序為“dsDNA+Pb2++AgNPs+混合溶液+Rh6G”時，線性關系較好。

圖11 加樣順序?qū)w系的影響Fig.11 Effects of sample order on system

2.5.6 共存物質(zhì)的影響

根據(jù)試驗方法探討在Pb2+-dsDNA-AgNPs 體系中，共存離子的存在條件下對測定結果的影響，結果見圖12。

圖12 共存物質(zhì)對體系的影響Fig.12 Effects of coexisting substances on the system

當Pb2+濃度為5.0×10-7mol/L 時，6.5×10-6mol/L Ba2+，3.9×10-6mol/L Cu2+，2.5×10-6mol/L K+，8.3×10-6mol/L Co2+，2.5×10-6mol/L Ca2+，5.0×10-6mol/L Fe3+，2.0×10-7mol/L Hg2+，1.5×10-5mol/L Ni2+，1.2×10-5mol/L Ag+，5.0×10-6mol/L Mn2+，1.5×10-5mol/L 異亮氨酸、天冬氨酸、精氨酸等干擾物質(zhì)對Pb2+的測定無干擾，且相對誤差在±10%內(nèi)。

2.6 Pb2+-dsDNA-AgNPs 體系的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

探究Pb2+-dsDNA-AgNPs 體系的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，結果見表1。

按試驗方法，同一批次的AgNPs 測定2.5×10-7mol/LPb2+，同組平行測定10 次。不同批次的AgNPs 測定2.5×10-7mol/L Pb2+，同組平行測定10 次。結果表明，同一批次的AgNPs 測定2.5×10-7mol/L Pb2+，平均值均在誤差范圍10%之內(nèi)，不同批次的AgNPs 測定2.5×10-7mol/L Pb2+，平均值均在誤差范圍10%之內(nèi)，體系具有一定的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

表1 Pb2+-dsDNA-AgNPs 體系*的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性Table 1 Reproducibility and stability of Pb2+-dsDNA-AgNPs system*

2.7 工作曲線

Pb2+的標準曲線見圖13。

根據(jù)試驗方法，以AgNPs 作為基底，在最佳試驗條件下做工作曲線，Pb2+濃度與ΔI 的線性回歸方程為ΔI=16.962x-127.97，R2=0.993 5，如圖13 所示；Pb2+的檢測范圍在2.5×10-8到7.5×10-7mol/L 之間。本試驗方法是一種較好的快速檢測Pb2+的新方法。

2.8 與測定鉛的國標分析方法比較

圖13 Pb2+的標準曲線Fig.13 Standard curve of Pb2+

通過將DNA 酶SERS 測定痕量重金屬（Pb2+）與測定鉛的國標分析方法比較，得出結果如表2 所示，用國標法檢測痕量重金屬鉛，有其優(yōu)點和不足，而DNA 酶SERS 法，則是在其優(yōu)點的基礎上，彌補了其不足之處。

表2 測定Pb2+的國標分析方法比較Table 2 Comparison of GB analytical methods for determination of Pb2+

2.9 測定皮蛋中的重金屬鉛離子

取2.484 mg/mL 的皮蛋消解液樣品，以AgNPs 作為基底，按試驗方法測定鉛離子含量，結果見表3。

結果表明，相對標準偏差均在10%以內(nèi)，回收率在99.5%～107.7%之間。

表3 Pb2+-dsDNA-AgNPs 體系測定皮蛋中的Pb2+Table 3 Pb2+-dsDNA-AgNPs system for determination of Pb2+in preserved eggs

3 結論

通過采用還原法可快速制備黃色球形納米銀。在一定條件下，將ssDNA 和DNA 酶雜交形成dsDNA。在dsDNA 和混合溶液存在條件下，AgNPs 發(fā)生聚集，聚集的AgNPs 與Rh6G 作用較強，在613 cm-1處出現(xiàn)較強的SERS 特征峰。Pb2+可將dsDNA 裂解切割，釋放出ssDNA，形成比表面積和粗糙度均增大的AgNPs-ssDNA-Pb2+大分子締合物。隨著Pb2+濃度的增大，釋放出的ssDNA 增多，形成的AgNPs-ssDNA-Pb2+增多，Ag-NPs-ssDNA-Pb2+與Rh6G 作用增強，導致613 cm-1處的SERS 峰強度增大。在選定條件下，Pb2+在2.5×10-8～7.5×10-7mol/L 濃度之間，與其SERS 峰強度的變化值呈良好線性關系，ΔI=16.962x-127.97，R2=0.993 5，Pb2+的最低檢出濃度為1.0×10-8mol/L。用建立的方法測定皮蛋中的Pb2+，相對標準偏差（RSD）均在10%以內(nèi)，回收率在99.5%～107.7%之間。由此可知，該方法有望在檢測農(nóng)產(chǎn)品重金屬中，得以廣泛應用。