吳 晨， 邱玉保， 孫雪倩， 陳 丹， 吳亞先， 龐慶豐

(江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院， 江蘇 無錫 214122)

許多肝臟疾病，如膽結(jié)石，阻塞性黃疸，急性肝炎，原發(fā)性硬化性膽管炎和原發(fā)性膽汁性肝硬化等都會常導(dǎo)致肝臟膽汁淤積[1]。 膽汁從肝細胞到腸道的阻塞導(dǎo)致肝臟組織中的膽汁酸積累，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，炎癥，細胞凋亡和纖維化，最終發(fā)展為肝硬化。然而，熊去氧膽酸(UDCA)與巴替酸(OCA)聯(lián)合用藥是迄今為止唯一批準的臨床慢性膽汁淤積性肝病治療方法[2]。但OCA的價格昂貴，費用-療效比不盡樂觀，因此，盡快開發(fā)出大部分患者都可以承擔(dān)的膽汁淤積治療藥物極為重要。姜黃素是一種天然黃色多酚，價格適中，因其抗氧化，抗炎，抗突變和抗致癌性質(zhì)而被認為是一種藥用植物[3]，一些研究報道姜黃素可以上調(diào)血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)并抑制各種肝臟疾病，如急性肝損傷[4]，酒精性肝病[5]和肝纖維化[6]，但尚不清楚姜黃素是否對膽汁淤積性肝損傷有保護作用。本研究通過模擬小鼠膽汁淤積性肝纖維化模型，探討姜黃素對小鼠膽管結(jié)扎所致的膽汁淤積性肝纖維化是否具有保護作用及其作用機制，為肝纖維化治療提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 試劑及抗體

姜黃素(Cat#C1386)，鋅原卟啉IX(ZnPP，Cat#282820)，P450還原酶(Cat#C8113)，β-NADPH(Cat#N5130)均購自美國Sigma-Aldrich公司。 天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)檢測試劑盒購自中國南京建成生物工程研究所。HO-1(Cat#ab13248)，髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)(Cat#ab9535)的一抗購自美國Abcam公司。小鼠含生長因子樣模體粘液樣激素樣受體(EMR1, 又稱F4 / 80)(Cat#MCA497GA)購自美國BIO-RAD公司。

1.2 實驗動物分組及模型建立

所有動物實驗均按照相關(guān)法律和機構(gòu)指南進行，并經(jīng)江南大學(xué)實驗動物使用倫理委員會批準。BALB/c小鼠(6～8周，體重20～25 g)隨機分為5組：假手術(shù)組(n=6)，假手術(shù)組+姜黃素組(n=6)，BDL(n=10)，BDL +姜黃素(n=10)和BDL +姜黃素+ ZnPP(n=10)。使所有動物適應(yīng)適當(dāng)?shù)沫h(huán)境7 d。BDL組、BDL+姜黃素組以及BDL+姜黃素+ZnPP組小鼠如文獻所述進行了BDL手術(shù)[7]：對小鼠進行開腹后，輕輕剝開肝臟，找到與肝門靜脈伴行的一條透明膽管，用4-0手術(shù)線進行兩次結(jié)扎，將肝臟復(fù)位后，縫合小鼠。假手術(shù)組的小鼠如造模組一樣接受剖腹手術(shù)并分離了膽管但不進行結(jié)扎。BDL手術(shù)7 d后，假手術(shù)+姜黃素組以及BDL+姜黃素組小鼠每日進行一次姜黃素(30 mg/kg)[8-9]腹腔注射；BDL+姜黃素+ZnPP組小鼠每日腹腔注射姜黃素(30 mg/kg)以及ZnPP(50 μmol/kg)[10]一次，；假手術(shù)組和BDL組，小鼠每日腹腔注射等體積的生理鹽水一次，所有給藥過程持續(xù)7 d。BDL手術(shù)14 d后，各組小鼠摘眼球取血，收集肝臟組織，取部分肝組織用4%多聚甲醛固定，進行組織學(xué)檢查。另一部分立即儲存在-80℃，用于qRT-PCR、WB、HO-1活性檢測。

1.3 血清生化分析

BDL手術(shù)14 d后，各組小鼠摘眼球取血，在4℃冰箱中靜置過夜后，得到血清。

1.3.1 血清谷草轉(zhuǎn)氨酶 (aspartate aminotransferase, AST) 檢測 采用南京建成生物研究所購買的AST試劑盒進行檢測，簡要操作步驟如下：在測定孔與對照孔中加入20 μl由-酮戊二酸及天門冬氨酸組成的基質(zhì)液及5 μl待測血清樣本，吹打混勻后，37℃水浴30 min。在測定孔與對照孔中加入20 μl 2,4二硝基苯肼液，在對照孔中加入5 μl待測血清樣本，吹打混勻，37℃水浴30 min。從孵箱中拿出孔板，在測定孔和對照孔中加入200 μl 0.4 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻后室溫放置15 min，酶標儀510 nm處測各孔OD值。絕對PD值=測定孔OD值-對照孔OD值, 查提前做好的標準曲線得各組相應(yīng)AST活力單位。

1.3.2 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (alanine aminotransferase, ALT) 檢測 采用南京建成生物研究所購買的AST試劑盒進行檢測，簡要操作步驟如下：在測定孔與對照孔中加入20 μl由-酮戊二酸及丙氨酸組成的基質(zhì)液及5 μl待測血清樣本，吹打混勻后，37℃水浴30 min。在測定孔與對照孔中加入20 μl 2,4二硝基苯肼液，在對照孔中加入5 μl待測血清樣本，吹打混勻，37℃水浴30 min。從孵箱中拿出孔板，在測定孔和對照孔中加入200 μl 0.4 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻后室溫放置15 min，酶標儀510 nm處測各孔OD值。絕對PD值=測定孔OD值-對照孔OD值, 查提前做好的標準曲線得各組相應(yīng)AST活力單位。

1.4 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察肝纖維化

將剪成合適大小的肝組織在4%多聚甲醛中固定48 h，石蠟包埋后切成4 μm切片。根據(jù)標準程序進行HE染色和天狼星紅染色。

1.5 免疫組化檢測肝組織F4 / 80及MPO

取小鼠肝臟組織進行4%多聚甲醛固定，進行常規(guī)梯度酒精脫水及二甲苯透明處理后，石蠟包埋并用組織切片機進行組織切片。將肝組織切片與HO-1(1∶200稀釋)，F(xiàn)4 / 80(1∶100稀釋)，MPO(1∶50稀釋)一抗和生物素化二抗(1∶200稀釋)孵育適當(dāng)時間，DAB顯色，在德國卡爾蔡司LAM 510光學(xué)顯微鏡下觀察所有切片，使用Image J軟件對免疫組化染色陽性細胞進行統(tǒng)計。

1.6 Western blot檢測肝組織HO-1蛋白表達

參照文獻[11]，稱取各組樣品30 mg，在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中，在冰上勻漿30 min，12 000 r/min、4℃離心10 min，然后收集上清液，BCA法定量。取20 μg蛋白樣品依次經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉、HO-1一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜、二抗室溫孵育1 h、ECL顯色。GAPDH(1∶10 000)作為內(nèi)參。

1.7 肝組織HO-1活性檢測

參照文獻[12]，簡要步驟如下：稱取小鼠肝臟組織約30 mg，加入預(yù)冷的400 μl含有PMSF的RIPA裂解液，將EP管插放在冰上進行手動勻漿，勻漿完成后以200 s一次的頻率于渦旋儀上渦旋10 s，20 min后，在提前4℃預(yù)冷好的離心機中，12 000 r/min離心10 min，收集含有蛋白的上清，并用BCA法測量蛋白濃度。HO-1活性檢測的反應(yīng)體系為200 μl：25 μmol/L hemin、1 mmol/L NADPH、5 mmol/L去鐵胺、0.6 U細胞色素C、80 μl小鼠肝膽綠素還原酶提取液、200 μg細胞全蛋白、剩余用PBS補足。

1.8 RT-PCRt檢測小鼠肝組織中HO-1 mRNA表達水平

取15 mg各組小鼠肝臟組織，使用RNA prep Pure Tissue Kit制備總RNA。通過260和280 nm處的吸光度比評估樣品的RNA產(chǎn)率和純度。使用PrimeScript TM RT Master Mix試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。 根據(jù)系統(tǒng)方案SYBR Premix Ex Taq(Takara，Japan)進行qPCR。 本研究中的所有引物均由Sangon Biotech (中國上海)合成。定量使用GAPDH作為參照基因的2-ΔΔCt方法。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對BDL誘導(dǎo)的小鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響

假手術(shù)的小鼠肝臟在14 d時表面光滑，而BDL小鼠顯示出結(jié)構(gòu)改變，肝臟表面出現(xiàn)水腫和纖維化結(jié)節(jié)(圖1A)。在組織學(xué)檢測中也證實由BDL手術(shù)誘導(dǎo)的肝臟特征性形態(tài)學(xué)改變，如膽管增生，炎性細胞浸潤，肝小葉被分割、肝細胞腫脹形成不規(guī)則形狀且細胞核被擠壓至邊緣(圖1C)。與假手術(shù)組小鼠相比，BDL處理的小鼠肝細胞損傷標記物ALT(P<0.01)和AST(P<0.01)顯著升高(圖1B);另外，BDL小鼠的肝臟重量與體重比與假手術(shù)組小鼠相比也出現(xiàn)升高(圖1A)。 補充姜黃素后，這些情況均得到改善，表明姜黃素減弱了BDL誘導(dǎo)的肝損傷。

Fig.1Curcumin attenuated BDL-induced liver injury

(A) BALB/c mice were randomly divided into sham group (n=6), sham+ curcumin group (n=6)，BDL group (n=10) and BDL+ curcumin group (n=10). After two weeks the visceral cavity was opened and the liver to body weight ratio was measured. (B) Serum levels of AST and ALT in sham (n=6), sham+ curcumin (n=6)，BDL (n=10), BDL+ curcumin group (n=10).(C) The obtained liver sections were subjected to histological examination. Representative photomicrographs of H&E were shown. Original magnification: ×200.Values represent mean±SD.

2.2 姜黃素對BDL誘導(dǎo)的肝纖維化和炎癥的影響

天狼星紅染色結(jié)果(圖2A)顯示，姜黃素+BDL組與BDL組相比，肝組織中膠原蛋白沉積減少，促肝纖維化標志物的mRNA含量也明顯下降(圖2B，2C)，表明連續(xù)7 d以30 mg/kg劑量用姜黃素治療減少BDL導(dǎo)致的肝纖維化。同時，免疫組化染色結(jié)果(圖2D,2E)顯示，與BDL組相比，補充姜黃素可顯著減少巨噬細胞標記物F4/80以及中性粒細胞標記物MPO的表達，減輕BDL誘導(dǎo)的炎癥細胞浸潤。這些結(jié)果表明，姜黃素對BDL誘導(dǎo)的肝纖維化和炎癥具有減弱作用。

Fig.2Curcumin attenuated BDL-induced liver fibrosis and inflammation

(A) The obtained liver sections were subjected to histological examination. Representative photomicrographs of Sirius red staining were shown. Original magnification: ×100.mRNA expression levels of collagen type I (B) and TGF-β1 (C) in sham (n=6), sham+ curcumin (n=6)，BDL (n=10), BDL+ curcumin (n=10) group. Values represent mean±SD. The obtained liver sections were subjected to immunohistochemical examination with antibody against F4/80 (D) and MPO (E), Representative photomicrographs are shown (left panel), original magnification: ×400.Percentage of F4/80-positive cells and MPO-positive cells (right panel) of each group was quantitative analysed.

2.3 姜黃素對肝組織中HO-1表達水平的影響

與假手術(shù)組相比，BDL造模14 d后，小鼠肝組織中的HO-1蛋白表達量(圖3A,3C)及mRNA含量(圖3B)均有所上升(P<0.01),在補充姜黃素后，小鼠肝臟HO-1表達量進一步顯著上升。根據(jù)以上實驗結(jié)果，我們猜測，姜黃素對小鼠BDL所致的肝纖維化的保護作用可能是通過誘導(dǎo)HO-1表達實現(xiàn)的。

Fig.3Curcumin enhanced mRNA and proteins expression levels of HO-1

(A) The obtained liver sections were subjected toimmunohistochemical examination with antibody against HO-1. Representative photomicrographs are shown (left panel), original magnification: ×400.Percentage of ho-1-positive cells (right panel) of each group was quantitative analysed. (B) mRNA expression levels of HO-1 in sham (n=6), sham+ curcumin (n=6)，BDL (n=10), BDL+ curcumin (n=10) group. (C) Proteins were isolated from liver tissues and subjected to Western bolt with antibody against HO-1. Representative bolts (left panel) and quantitative analysis (right panel) were shown. Values represent mean±SD.

2.4 HO-1抑制劑ZnPP加重BDL誘導(dǎo)的肝損傷

為了進一步驗證我們的假設(shè)，我們在補充姜黃素的同時連續(xù)7 d對姜黃素給藥小鼠進行50 μmol/ kg的鋅原卟啉(ZnPP)腹腔注射。ZnPP是血紅素降解途徑中的限速酶，具有特異性抑制HO-1酶活性的能力(圖4A)，而對HO-1的mRNA水平(圖4B)或蛋白質(zhì)表達(圖4C)沒有影響。在ZnPP處理后的BDL小鼠中，仍然發(fā)現(xiàn)了實質(zhì)壞死，以及大量新形成的膽管(圖4D)和I型膠原沉積(圖4E)，提示姜黃素對BDL小鼠的保護作用被逆轉(zhuǎn)。I型膠原蛋白的mRNA水平升高(圖4F)，提示ZnPP消除了姜黃素對BDL小鼠肝纖維化的保護作用。因此我們得出結(jié)論，姜黃素對小鼠BDL所致的肝纖維化的保護作用是通過誘導(dǎo)HO-1表達實現(xiàn)的。

3 討論

膽汁淤積性肝損傷是慢性肝病患者肝纖維化和肝硬化發(fā)展的主要致病因素之一，同時臨床上的治療藥物十分有限。為了評估姜黃素對膽汁淤積性肝損傷的影響，我們使用BDL作為實驗?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)補充姜黃素可以改善BDL誘導(dǎo)的肝纖維化和炎癥等肝損傷，其機制可能與HO-1調(diào)控有關(guān)。

Fig.4HO-1 inhibitor, ZnPP, aggravated BDL-induced liver damage

(A) HO-1 activity was determined in liver. (B)mRNA expression levels of HO-1 in sham (n=6), BDL (n=6), BDL+curcumin (n=10), BDL+curcumin+ZnPP (n=10) group. (C) Proteins were isolated from liver tissues and subjected to Western bolt with antibody against HO-1. Representative bolts (left panel) and quantitative analysis (right panel) were shown. (D) The obtained liver sections were subjected to histological examination. Representative photomicrographs of H&E were shown. Original magnification: ×200.(E) The obtained liver sections were subjected to histological examination. Representative photomicrographs of Sirius red staining were shown. Original magnification: ×100.(F) mRNA expression levels of collagen type I in sham (n=6), BDL (n=6), BDL+ curcumin (n=10), BDL+curcumin+ZnPP (n=10) group. Values represent mean±SD.

姜黃素是一種黃色多酚類物質(zhì)，存在于香料姜黃的根莖中，具有抗氧化，抗炎，抗突變和抗致癌作用。近年來，已報道了姜黃素的保肝作用。Anggakusuma[13]發(fā)現(xiàn)姜黃素通過影響膜流動性從而抑制病毒結(jié)合和融合，從而獨立于基因型和原代人肝細胞抑制HCV進入，Eshaghian等[14]報道姜黃素可減輕BDL大鼠的肝纖維化和胰島素抵抗。在我們的研究中，補充姜黃素可降低血清中ALT和AST的水平，抑制細胞外基質(zhì)的沉積并減少炎癥細胞浸潤。這些結(jié)果與其他研究結(jié)果一致，表明姜黃素在肝臟保護中的廣泛應(yīng)用前景。

核因子紅細胞2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)通過與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合在氧化應(yīng)激中起關(guān)鍵作用[15]，可穩(wěn)定機體內(nèi)氧化-抗氧化平衡。蔡月琴等[16]發(fā)現(xiàn)，在非酒精性脂肪肝炎中，Nrf2及其下游調(diào)控因子(HO-1及NQP1等)可對抗氧化應(yīng)激導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，減緩疾病進程。HO-1是受Nrf2調(diào)節(jié)的主要應(yīng)激反應(yīng)因子。之前的研究表明，姜黃素可通過調(diào)節(jié)Nrf2 / HO-1途徑直接激活Nrf2表達并減輕肝損傷[17-18]。HO-1是血紅素分解代謝的限速酶，可催化游離血紅素代謝產(chǎn)生膽綠素、游離鐵離子和一氧化碳，具有突出的抗炎和抗氧化作用。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)姜黃素通過提高HO-1的表達來改善實驗性肝臟膽汁淤積，當(dāng)我們使用HO-1抑制劑ZnPP時，保護效果大大減弱。ZnPP是血紅蛋白合成時形成的一種微量正常代謝產(chǎn)物，是臨床上治療高膽紅素血癥的潛在藥物，藥效溫和，因此，我們有理由推測，ZnPP逆轉(zhuǎn)姜黃素對于實驗性肝臟膽汁淤積的保護作用是由于其特異性抑制了HO-1的活性，而非對機體造成了損害[19]。

綜上所述，本研究建立了模擬臨床狀態(tài)下小鼠肝纖維化模型，采用HO-1活性抑制劑ZnPP進行干預(yù)，顯示姜黃素可通過提高HO-1表達來減輕BDL所致的小鼠膽汁淤積性肝硬化，為臨床上有效地治療肝纖維化提供新的分子靶點和治療策略。