趙 海， 李 曦， 張 莉， 武 帥， 張永強， 李 軍， 張格祥， 楊丹鳳△

(1. 蘭州大學公共衛(wèi)生學院， 甘肅 蘭州 730000； 2. 軍事科學院軍事醫(yī)學研究院環(huán)境醫(yī)學與作業(yè)醫(yī)學研究所， 天津 300050； 3. 中國人民解放軍32110部隊衛(wèi)生連， 黑龍江 黑河 164300)

舒適的溫度對于人體維持健康至關(guān)重要，極端環(huán)境會影響人類健康。寒冷刺激會影響人類心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)[1-3]，已有研究表明冷環(huán)境造成人體諸多不適，并導致較高的住院率[4, 5]。有研究表明寒冷可以對雌性大鼠動情周期造成影響[6]，但寒冷影響動情周期的研究依然較少，機制尚不清楚。因此，建立寒冷所致動情周期紊亂模型對于研究動情周期健康顯得尤為重要。本研究通過建立寒冷對C57BL/6雌性小鼠動情周期的影響的模型，初步探討其可能的機制，為預防寒冷可能帶來的生殖傷害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡SPF級健康雌性C57BL/6小鼠12只，體重(17～20)g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)溫度(23±1)℃，12 h/12 h晝夜交替，自由攝食攝水。

1.2 實驗器材

微量加樣器、載玻片、生理鹽水、95%乙醇、HE染液、4%水合氯醛溶液、ELISA試劑盒(英國Biorbyt公司)、酶標儀(SpectraMax M5)、低溫離心機(Centrifuge 5417R)。

1.3 動物分組與處理

陰道細胞學涂片法觀察每只小鼠的動情狀況，一周后將動情周期均正常的12只小鼠隨機分為對照組、低溫組各6只。每兩天稱量一次體重。將低溫組小鼠每籠(460 mm×300 mm×160 mm)兩只放入(4±0.5)℃無風的低溫艙中，每日4 h(10:30～14:30)。將對照組小鼠用同樣的方法置于常溫動物房飼養(yǎng)。連續(xù)冷暴露2周，全部于動情間期(涂片中全部是白細胞)處死，取子宮和卵巢置于-80℃冰箱，血液經(jīng)心臟取血后離心機3 000 r/min離心15 min后吸取血清分裝后置于-80℃冰箱。ELISA試劑盒檢測血清性激素水平，子宮和卵巢做病理分析。

1.4 動情周期觀察

陰道細胞學檢查[6]。每日上午9點，用移液槍吸取適量生理鹽水后打入小鼠陰道并抽吸數(shù)次，涂于載玻片一端，晾干后用95%乙醇固定15 min，HE染色15 min后通過光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)，判斷每只小鼠所處的動情周期。

1.5 臟器系數(shù)的計算

1.6 性激素水平的測定

用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測每只小鼠血清雌二醇(estradiol, E2)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone, LH)、孕酮(progesterone, P)和催乳素(prolactin, Prl)水平，嚴格按照說明書操作。

1.7 組織病理學檢查

將剔除周圍脂肪及結(jié)締組織的子宮和卵巢立即投入4%多聚甲醛組織固定液中固定，經(jīng)過脫水、浸蠟、包埋、切片、HE染色、封片后，光鏡下觀察組織病理學變化。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 寒冷對小鼠動情周期的影響

小鼠動情周期一般為(4～5)d，包括動情前期(Proestrus)1 d、動情期(Estrus)1 d、動情后期(Metestrus)1 d和動情間期(Diestrus)1～2 d(圖1)。HE染色后光鏡下觀察，細胞清晰可見，周期容易辨別。與對照組小鼠相比，低溫組小鼠動情間期顯著延長(P<0.01)，其余各期未見顯著性差異(表1)。

Fig.1Microphotographs of cellular characteristics for the identification of the estrous stage (HE100)

A: Proestrus; B: Estrus; C: Metestrus; D: Diestrus

2.2 寒冷對小鼠體重和子宮臟器系數(shù)的影響

在動物建模過程中，各組小鼠行為活動無異常。在實驗期間內(nèi)兩組小鼠在體重上沒有顯著性差異(P>0.05，圖2)。與對照組相比，低溫組小鼠子宮臟器系數(shù)明顯較低(P<0.01，表1)。

Fig.2Effects of cold exposure on body weight gain (n=6)

2.3 寒冷對小鼠血清性激素水平的影響

與對照組相比，低溫組小鼠血清FSH明顯升高(P<0.01)，低溫組小鼠血清Prl明顯降低(P< 0.01)。血清E2、LH、P水平尚未見差異(P>0.05，表2)。

2.4 寒冷對小鼠子宮和卵巢組織病理學的影響

對照組小鼠子宮整體結(jié)構(gòu)正常，腔壁結(jié)構(gòu)各層完整清晰，上皮細胞呈單層柱狀，排列整齊，全層未見充血水腫，箭頭所示為子宮腺管，未見明顯炎癥細胞浸潤(圖3A)。低溫組小鼠子宮上皮細胞排列紊亂，組織可見子宮腺管極度擴張，如圖箭頭所示，未見充血水腫，未見明顯炎癥細胞浸潤(圖3B)。

對照組小鼠卵巢整體結(jié)構(gòu)正常，卵母細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，透明帶光滑，周邊顆粒細胞排列有序，組織未見明顯出血壞死，箭頭所示為卵泡，組織未見明顯炎癥細胞浸潤(圖3C)。低溫組小鼠卵巢整體結(jié)構(gòu)正常，卵母細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，透明帶光滑，組織可見卵泡數(shù)量明顯減少，箭頭所示為黃體，組織未見明顯炎癥細胞浸潤(圖3D)。

Tab. 1 Effects of cold exposure on estrous cycle and coefficient of uterus n=6)

**P<0.01vscontrol group

Tab. 2 Serum levels of E2, FSH, LH, P and Prl n=6)

E2: Estradiol; FSH: Follicle-stimulating hormone; LH: Luteinizing hormone; P: Progesterone; Prl: Prolactin

**P<0.01vscontrol group

Fig.3Morphological characteristics of uterus and ovary (HE100)

A: Control group uterus; B: Cold group uterus; C: Control group ovary; D: Cold group ovary

3 討論

寒冷作為一種環(huán)境因素可以對機體生殖功能產(chǎn)生影響[8]。本實驗從體重、子宮臟器系數(shù)、血清激素水平和子宮、卵巢組織病理學等方面進行了研究。有研究顯示寒冷可使冷暴露組雌性小鼠體重明顯低于對照組[9]，本研究中兩組小鼠體重無顯著差異。子宮臟器系數(shù)能反映寒冷對子宮重量的影響，與對照組小鼠相比，低溫組小鼠子宮臟器系數(shù)明顯較低，結(jié)合子宮組織病理學檢查結(jié)果，冷暴露對子宮實質(zhì)造成了損傷，以子宮上皮細胞排列紊亂和子宮腺管擴張為主。由此推測寒冷造成小鼠動情周期改變的原因可能與子宮損傷有關(guān)。

動情周期可以作為體內(nèi)激素水平變化或生殖器官如子宮和卵巢變化的指征[10]。動情前期雌激素水平最低，上皮細胞增殖緩慢，脫落細胞為有核上皮細胞；動情期雌激素水平到達高峰，刺激陰道上皮增殖，大量無核角化細胞脫落；動情后期屬于過渡期，三種細胞均可見[11,12]；動情間期雌激素水平較低，孕激素水平較高，白細胞數(shù)量增多，可保護機體免受微生物感染[13]。實驗結(jié)果表明，低溫組小鼠在冷刺激后呈現(xiàn)明顯的動情周期改變，主要表現(xiàn)為間期延長。有研究表明，冷暴露能夠改變雌性大鼠的動情周期，冷暴露后的雌性大鼠的動情期和動情間期明顯延長[6]，與本次實驗研究結(jié)果相近。還有研究顯示動情周期的不規(guī)則性可能與雌性小鼠的卵泡發(fā)育異常有直接的關(guān)系[14]，本實驗病理結(jié)果顯示卵泡數(shù)量明顯減少，提示寒冷可能造成卵泡發(fā)育異常，進而導致動情周期改變。因為周期變化是動態(tài)連續(xù)的過程，所以每只小鼠所處周期的具體時間難以精確計算，陰道細胞學檢查方法仍具有局限性。

血中雌激素水平的變化是反應周期變化的重要指征。E2由卵巢內(nèi)卵泡的顆粒細胞分泌，主要生理功能為促使子宮內(nèi)膜增生和增強子宮平滑肌收縮。FSH是垂體前葉嗜堿性細胞分泌的一種激素，主要生理功能為促進卵泡成熟。LH由垂體前葉嗜堿性細胞分泌，它作用于成熟的卵泡，能引起排卵并生成黃體，在有FSH存在下，與其協(xié)同作用，刺激卵巢雌激素分泌，使卵泡成熟與排卵[15]。Prl為腺垂體分泌的一種蛋白質(zhì)激素，其對乳腺的作用主要為促進乳腺發(fā)育生長，引起并維持泌乳。P是卵巢分泌的具有生物活性的主要孕激素，可保護子宮內(nèi)膜，與雌激素具有協(xié)同作用。這些激素對于維持子宮和卵巢內(nèi)環(huán)境起著重要作用。本次實驗低溫組小鼠FSH高于對照組，提示寒冷可能使垂體前葉分泌FSH增加，進一步使得動情周期延長。性激素分泌受下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控，互相影響且較為復雜。有研究表明冷暴露能夠引起雌性大鼠生殖激素受體表達在分子水平上的破壞，動情周期改變可能與子宮損傷有關(guān)[6]。

綜上所述，寒冷可致小鼠血清激素水平和子宮、卵巢組織發(fā)生改變，動情周期延長，進而影響生殖功能，但其機制仍需進一步研究探討。