周 翠， 李檬妤， 劉朝霞， 李克榮， 葉 紅， 雷麗芳， 陳琰姝， 許奕華

(1. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院， 湖北 武漢 430030； 2. 湖北省襄陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院， 襄陽(yáng) 441000； 3. 廣東省中醫(yī)院， 廣州 510120)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種發(fā)病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，臨床上以記憶障礙、失語(yǔ)、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征。據(jù)報(bào)道，65歲以上老年人AD的患病率約為6%，且患病人數(shù)持續(xù)上升，預(yù)計(jì)到2050年，全球AD患者將從目前的5000萬(wàn)人增加至1.4億人[1]。目前，臨床上AD的治療除了常規(guī)藥物治療外，針灸的療效也得到充分肯定[2]。艾灸作為傳統(tǒng)中醫(yī)療法之一，在治療神經(jīng)退行性疾病方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可減輕藥物的毒副作用，改善患者軀體化癥候群，穩(wěn)定患者情緒[3]。然而，盡管臨床上已廣泛使用艾灸治療AD，但其基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方面研究仍相對(duì)較少，且集中于對(duì)動(dòng)物行為學(xué)的影響。血腦屏障是血液與腦組織間的特殊屏障，能阻止有害物質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi)而損傷神經(jīng)元，血腦屏障的損傷是AD、帕金森癥等神經(jīng)退行性疾病腦部的重要病理特征之一[4]。因此，本研究擬建立AD大鼠模型，通過(guò)以血腦屏障結(jié)構(gòu)與功能變化為研究點(diǎn)，明確艾灸對(duì)AD的治療作用及潛在機(jī)制，為艾灸治療AD的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，48只，體質(zhì)量為180～220 g，由華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(鄂)2016-0009。實(shí)驗(yàn)期間大鼠均飼養(yǎng)在室溫(24±2)℃、相對(duì)濕度(50±5)%、光/暗周期12 h/12 h的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中，自由攝食飲水。

1.2 試劑與主要儀器

Aβ25-35購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗鼠MMP-2、MMP-9多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；DAB試劑盒、蘇木素購(gòu)自北京中杉金橋；山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德；清艾條購(gòu)自蘇州醫(yī)療用品有限公司；DW-2000型腦立體定位儀、TM-Vision動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶系統(tǒng)購(gòu)自成都泰盟有限公司；Primotech普通光學(xué)顯微鏡購(gòu)自德國(guó)ZEISS公司；H800透射電鏡購(gòu)自日本日立公司；MK3型酶標(biāo)儀、HM355S組織切片機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3 動(dòng)物分組與造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，根據(jù)體質(zhì)量值隨機(jī)分為4組，包括正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組及艾灸組，每組12只。模型組及艾灸組均采用雙側(cè)海馬一次性注射聚集態(tài)Aβ25-35的方法建立AD大鼠模型[5]，具體操作如下：大鼠麻醉后，將其頭部固定于腦立體定位儀上，腦部皮膚消毒后，剪開(kāi)頭皮以露出顱骨，以前囟為坐標(biāo)原點(diǎn)，分別定位兩側(cè)海馬區(qū)(X：±2.1 mm，Y：-3.5 mm，Z：-2.7 mm)；采用顱鉆于定位處鉆孔，然后將微量進(jìn)樣器垂直插入，緩慢注射1 μl聚集態(tài)的Aβ25-35液(5 μg/μl)，留針5 min，使Aβ25-35液充分浸潤(rùn)周圍組織；縫合大鼠腦部皮膚，撒青霉素粉末防止感染。假手術(shù)組大鼠于相同部位注射等量生理鹽水，正常對(duì)照組正常飼養(yǎng)。

1.4 艾灸治療

于造模完成后24 h開(kāi)始艾灸治療，參照林文注主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》分別選取“百會(huì)”、“腎俞”、“印堂”穴，于穴上方2～3 cm處艾條溫和灸，每穴艾灸10 min，每天1次，持續(xù)治療21 d。除艾灸組外，其余各組大鼠均不予以治療。

1.5 Morris水迷宮測(cè)試

于治療第17日開(kāi)始在Morris水迷宮中進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，連續(xù)4 d，以評(píng)價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，具體方法如下：將水迷宮均勻劃分為4個(gè)區(qū)域，在左下方區(qū)域水面上2 cm處放置一個(gè)暗色平臺(tái)，將大鼠于右上方面向池壁放入，記錄其找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)，若60 s內(nèi)未找到，則將其引導(dǎo)至平臺(tái)，停留5 s；在連續(xù)4 d學(xué)習(xí)后，于治療第21日進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)大鼠的記憶能力，具體方法為：撤去平臺(tái)，依然將大鼠從右上方面向池壁放入，記錄其60 s內(nèi)在原平臺(tái)所在區(qū)域的停留時(shí)間(空間探索時(shí)間)。

1.6 血腦屏障的通透性檢測(cè)

采用伊文思藍(lán)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠血腦屏障的通透性，評(píng)價(jià)其損傷程度。于取材前1 h給予大鼠尾靜脈注射2%的伊文思藍(lán)(4 ml/kg)，大鼠皮膚、四肢變藍(lán)表示注入成功。1 h后麻醉大鼠，生理鹽水灌注完成后斷頭取腦，稱重，置于5 ml甲酰胺溶液中，54℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，離心，取上清，酶標(biāo)儀測(cè)定其630 nm處的吸光度值，計(jì)算腦組織中伊文思藍(lán)含量(μg/g)。

1.7 透射電鏡觀察

大鼠麻醉后，打開(kāi)胸腔，經(jīng)左心室依次灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，灌注完成后，剝離出海馬組織，切取大小約1 mm3塊狀，用2.5%戊二醛和1%鋨酸固定，丙酮逐級(jí)脫水，包埋劑包埋，超薄切片(50 nm)，采用醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察并攝片。

1.8 免疫組化實(shí)驗(yàn)

取固定好的大鼠腦組織，常規(guī)石蠟包埋后以5 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，水化，滴加山羊血清封閉液，37℃孵育30 min，去除血清，加一抗(1∶100稀釋)4℃孵育過(guò)夜；PBS洗3次，滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔50 μl，37℃孵育30 min，PBS洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察(200倍)。選取3個(gè)不同的視野，借助Image Pro軟件計(jì)算海馬MMP-2及MMP-9的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。每組檢測(cè)6個(gè)樣本。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 艾灸對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

在定位航行實(shí)驗(yàn)中， 隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，各組大鼠逃避潛伏期時(shí)間均有不同時(shí)間的縮短，第4日時(shí)，模型組大鼠逃避潛伏期時(shí)間較對(duì)照組和假手術(shù)組顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，學(xué)習(xí)功能受損，而艾灸治療能增強(qiáng)模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能(P<0.05)；在第5日的空間探索實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間明顯變少(P<0.01)，學(xué)習(xí)記憶功能受損，而艾灸治療能延長(zhǎng)其探索時(shí)間(P<0.05，表1)，改善學(xué)習(xí)記憶功能。

Tab. 1 Comparison of learning and memory ability of rats in each group (s, n=12)

**P<0.01vscontrol or sham；#P<0.05vsmodel

2.2 艾灸對(duì)AD模型大鼠血腦屏障通透性的影響

正常對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠腦組織伊文思藍(lán)的含量分別為(2.95±0.31)μg/g和(3.28±0.39)μg/g，而模型組大鼠腦組織伊文思藍(lán)含量為(8.76± 1.02)μg/g，顯著高于前兩組(P<0.01)，表明血腦屏障通透性增加；在艾灸治療后，伊文思藍(lán)含量為 (5.24±0.61)μg/g，與模型組比較顯著下降(P< 0.05)，說(shuō)明血腦屏障功能得到一定程度的修復(fù)。

2.3 艾灸對(duì)AD模型大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的影響

正常對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜完整清晰，核仁形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞連續(xù)性較好，基底膜厚度均勻，未見(jiàn)血管周圍有水腫現(xiàn)象；模型組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞邊界模糊，管腔狹窄，基底膜增厚，部分區(qū)域撕裂，血管周圍明顯水腫變大；艾灸組大鼠血管周圍水腫明顯減輕，僅局部輕微水腫，基底膜厚度恢復(fù)正常，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)趨于完整，血腦屏障損傷情況整體得到改善(圖1)。

Fig.1Electron microscopic observation of blood-brain barrier of each group of rats (×25 000)

2.4 艾灸對(duì)AD模型大鼠海馬MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元缺失明顯，細(xì)胞排列散亂，MMP-2和MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著增加(P<0.01)；艾灸治療后，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量增加，排列較為整齊，整體損傷情況得到緩解，同時(shí)MMP-2和MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均有所減少(P<0.05或P<0.01，圖2-3，表2)。

Fig.2Immunohistochemical staining results of hippocampal MMP-2 in each group of rats (×200)

Fig.3Immunohistochemical staining results of hippocampal MMP-9 in each group of rats (×200)

GroupMMP-2 MMP-9 Control29.84±4.9226.34±3.80Sham27.64±5.31 30.29±4.81Model48.90±5.92?? 51.02±6.07??Moxibustion38.76±5.01#34.91±4.63##

**P<0.01vscontrol or sham；#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3 討論

AD的治療目前仍是世界醫(yī)學(xué)難題，臨床主要以膽堿酯酶抑制劑和NMDA受體拮抗劑兩類藥物為主，盡管在延緩疾病的進(jìn)程進(jìn)展上療效顯著，但對(duì)患者神經(jīng)功能的恢復(fù)作用仍十分有限[6]。同時(shí)，西藥長(zhǎng)期服用所產(chǎn)生的不良反應(yīng)及藥物的依賴性反而容易使患者產(chǎn)生嚴(yán)重的心理壓力，甚至并發(fā)抑郁癥狀，加重AD的病程[7]。目前，西藥聯(lián)合針灸治療AD在臨床上已十分常見(jiàn)，艾灸屬于中醫(yī)針灸療法中的灸法，以熏烤人體的穴位而達(dá)到保健治病、延緩衰老的功效。中醫(yī)認(rèn)為，AD的關(guān)鍵病機(jī)為腎精虧虛、髓海不足，與腦、腎相關(guān)，而“百會(huì)”、“腎俞”、“印堂”穴正是與腦、腎關(guān)系密切的穴位，灸之能扶正祛邪、益腎補(bǔ)腦、壯髓醒神[8]。本研究在建立AD大鼠模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)持續(xù)21 d的艾灸治療，發(fā)現(xiàn)模型大鼠的學(xué)習(xí)與記憶功能均得到改善，療效明顯。

血腦屏障是血液與腦組織間的一種特殊屏障，是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)，主要功能是阻止有害物質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi)，同時(shí)讓營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物等選擇性通過(guò)，從而維持腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[9]。在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是神經(jīng)退行性疾病中，血腦屏障的結(jié)構(gòu)與功能通常都受到損壞，導(dǎo)致局部通透性增加，腦組織內(nèi)環(huán)境紊亂，最終造成神經(jīng)元的損傷[10-11]。研究表明，血腦屏障滲透性的增加會(huì)促進(jìn)老年斑的加速形成，加重AD的疾病進(jìn)程[12]。Arbo BD等[13]研究發(fā)現(xiàn)，血腦屏障受損后，負(fù)責(zé)將Aβ轉(zhuǎn)出腦組織的主要載體LRP1和P-gp表達(dá)減少，而將Aβ由血管內(nèi)轉(zhuǎn)入腦組織的糖基化終產(chǎn)物受體RAGE增加，促進(jìn)Aβ腦內(nèi)聚集和沉積，并進(jìn)一步加重血腦屏障的損傷。由此可見(jiàn)，Aβ的聚積與血腦屏障的損傷互為因果，均與AD的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)?；|(zhì)金屬蛋白酶類(MMPs)是能通過(guò)降解血管內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)而廣泛參與血腦屏障的破壞過(guò)程，其中MMP-2和MMP-9降解能力最強(qiáng)，研究也最為深入，是評(píng)價(jià)血腦屏障完整性的關(guān)鍵指標(biāo)[14]。本研究中，在雙側(cè)海馬注射Aβ25-35后，大鼠腦內(nèi)血管周圍明顯水腫變大，內(nèi)皮細(xì)胞邊界模糊，基底膜增厚，伊文思藍(lán)含量及MMP-2、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)均顯著增加，說(shuō)明AD模型大鼠血腦屏障結(jié)構(gòu)與功能均受到明顯損壞，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]；在艾灸治療后，模型大鼠血腦屏障損傷得以改善，通透性降低，MMP-2和MMP-9表達(dá)下降，對(duì)血腦屏障的完整性起到很好的保護(hù)作用。

綜上，本研究表明，艾灸能顯著改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其作用可能與調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，保護(hù)血腦屏障結(jié)構(gòu)與功能有關(guān)。本研究結(jié)果對(duì)于艾灸治療AD的實(shí)驗(yàn)研究與臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，但艾灸治療AD更深入的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。