沈 娟， 張雪峰， 郝 琴， 趙 琳， 楊彥玲

(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 延安 716000)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重創(chuàng)傷，因高病死率和高致殘率一直成為醫(yī)學(xué)研究的熱門課題[1-4]。乙酰左旋肉堿(acetyl-L- carnitine，ALC)是左旋肉堿的乙?；?，是一種強(qiáng)有效的抗氧化劑，且極易通過(guò)血腦屏障[5]，代謝清除率高，副作用少，是一種治療SCI理想的臨床藥物。大量資料顯示ALC具有促進(jìn)脂肪代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)能量、抗氧化、抗炎癥、抑制凋亡等多種生物學(xué)作用[6]，目前臨床主要用于腦缺血、阿爾茨海默病、糖尿病神經(jīng)病變、神經(jīng)退行性疾病的治療[7]。但目前脊髓損傷仍然是臨床治療和研究領(lǐng)域亟待攻克的世界難題，尋求和開(kāi)發(fā)臨床更為安全有效的治療藥物仍然意義重大。因此，本實(shí)驗(yàn)采用ALC干預(yù)脊髓損傷大鼠，觀察不同濃度ALC對(duì)脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，以及損傷節(jié)段脊髓組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，探討其對(duì)脊髓損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

ALC(Sigma-Aldrich)，SOD和MDA試劑盒(南京建成生物)、TUNEL試劑盒(上海碧云天)、DAPI染色液(上海碧云天)。

HI-0400脊髓打擊器(美國(guó)PSI公司)，LC-2010高效液相色譜儀(島津)，石蠟切片機(jī)2245(湖北徠克醫(yī)療)，熒光顯微鏡、數(shù)碼攝像顯微圖像系統(tǒng)DP70 CK40-F200(日本O-lympus)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

64只8-10周雌性SD大鼠，體重(220±20)g，清潔級(jí)(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)，許可證號(hào)：陜(SCXK2017-003)。

1.3 大鼠脊髓損傷模型制備

腹腔注射2%戊巴比妥鈉以40 mg/kg劑量麻醉大鼠，制備急性脊髓損傷模型，采用HI-0400脊髓打擊器，以T10為中心造成大鼠脊髓不完全損傷，打擊力度為200 kdyn。脊髓損傷模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)：打擊后，脊髓打擊處充血水腫，大鼠隨即出現(xiàn)擺尾反射和軀體、雙下肢回縮樣撲動(dòng)，雙下肢呈弛緩性癱瘓，視為大鼠脊髓損傷模型成功。術(shù)后腹腔注射青霉素鈉2×105U/kg，每日膀胱按摩3次至大鼠可自主排尿。

1.4 動(dòng)物分組及給藥方法

SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、急性脊髓損傷組(SCI)和高、中、低ALC治療組(SCI+ALChigh、SCI+ALCmedium、SCI+ALClow)共5組，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)每組8只，氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)每組3只。依據(jù)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)，篩選出ALC的最佳劑量，隨后將9只大鼠隨機(jī)分為Sham，SCI，SCI+ALC3組，每組3只，用于TUNEL實(shí)驗(yàn)。Sham組只打開(kāi)椎板暴露脊髓，不進(jìn)行打擊；SCI+ALChigh、SCI+ALCmedium、SCI+ALClow組術(shù)后30 min內(nèi)分別腹腔注射300、200、100 mg/kg的ALC，每天一次連續(xù)給藥1周，7 d后每周1次；給藥至術(shù)后第5周；SCI組同時(shí)間點(diǎn)注射等量生理鹽水。

1.5 灌流及取材

在大鼠術(shù)后第3日各組分別處死大鼠3只，用于SOD、MDA檢測(cè)和HPLC檢測(cè)。術(shù)后第7日，各組分別處死大鼠3只，用于TUNEL染色。第42日各組處死大鼠3只用于HE染色。大鼠深度麻醉后，固定大鼠并暴露心臟，右心耳取靜脈血，后經(jīng)升主動(dòng)脈快速灌注生理鹽水100 ml，部分大鼠新鮮脊髓組織-80℃保存，靜脈血-20℃?zhèn)溆?。部分大鼠?%多聚甲醛400 ml灌注固定，以損傷中心上下各1.5 cm取脊髓組織3 cm，4%多聚甲醛后固定，梯度脫水、石蠟包埋、5 μm厚切片，用于組織切片染色。

1.6 檢測(cè)方法

采用BBB評(píng)分法[8-9 ]和Rivlin 斜板實(shí)驗(yàn)[8]對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分；嚴(yán)格按試劑盒內(nèi)步驟檢測(cè)脊髓組織中SOD活性和MDA含量測(cè)定；高效液相(HPLC)測(cè)定血清中ALC含量；缺口原位末端標(biāo)記測(cè)定法(TUNEL)檢測(cè)脊髓細(xì)胞凋亡指數(shù)；HE染色觀察損傷節(jié)段脊髓組織形態(tài)改變。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)評(píng)價(jià)ALC對(duì)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的影響

2.1.1 BBB評(píng)分比較 各組大鼠在3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行BBB評(píng)分。ALChigh、ALCmedium組在各時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分與SCI組相比，均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；而ALClow組在四周以后與SCI組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；而在四周前與SCI組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表1)。數(shù)據(jù)分析結(jié)果得出：中、高劑量組均可明顯改善大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能，其中ALChigh組效果最佳。

Tab. 1 BBB scores after SCI in n=8 )

*P<0.05，**P<0.01vsSCI group

2.1.2 大鼠Rivlin 斜板實(shí)驗(yàn)臨界度數(shù)均值比較 各組大鼠在3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行Rivlin評(píng)分。ALChigh組、ALCmedium在各時(shí)間點(diǎn)最大傾斜角與SCI組相比，均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；而ALClow組僅在7 d、14 d與SCI組相比，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，其余時(shí)間點(diǎn)ALClow組與SCI組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，表2)。數(shù)據(jù)分析結(jié)果得出：中、高劑量組傾斜角度臨界值明顯增大，大鼠四肢抓力明顯增強(qiáng)，其中ALChigh組效果最佳。

Tab. 2 Maximum oblique angle of Rivlin experiment in rats (°， n=8)

*P<0.05，**P<0.01vsSCI group

2.2 大鼠損傷節(jié)段脊髓組織中SOD、MDA的含量

取脊髓損傷第3日脊髓組織，勻漿后取組織上清液進(jìn)行檢測(cè)。ALCmedium組和ALChigh組MDA含量和SOD活力與SCI組相比，均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；ALClow組MDA含量和SOD活力與SCI組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，表3)。

GroupMDA(nmol/mg prot)SOD(U/mg port)Sham 2.363±0.176??187.5±3.4??SCI6.316±0.318135.0±1.2SCI+ALClow5.676±0.345?143.2±2.2?SCI+ALCmedium4.823±0.503??153.3±1.9??SCI+ALChigh3.853±0.478??159.9±2.8??

*P<0.05，**P<0.01vsSCI group

2.3 HPLC測(cè)定血清中ALC含量

取脊髓損傷后第3日血清樣品，在[色譜柱：250 mm×4.6 mm，5 μm；流動(dòng)相：20 mmol乙酸胺+乙腈(0.1%甲酸)(25+75，v/v)；流量：1.0 ml/min；柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，進(jìn)樣量為10 ml/min上述色譜條件下，ALC標(biāo)準(zhǔn)品溶液、各組新鮮血清樣品均峰形良好，保留時(shí)間為26 min(圖1)。ALC標(biāo)準(zhǔn)品的溶液和SCI+ALC組新鮮血清中樣品與在260 nm處具有相同的紫外吸收光譜，而Sham組(A)和SCI組(B)新鮮血清中樣品在260 nm處未出現(xiàn)光譜值。說(shuō)明脊髓損傷后體內(nèi)無(wú)內(nèi)源性ALC產(chǎn)生，而給藥組血清中均可檢測(cè)到與標(biāo)準(zhǔn)品相同的ALC物質(zhì)。

Fig.1HPLC chromatogram(n=3)

A: HPLC chomatogram of Sham group; B: HPLC chomatogram of SCI group; C: HPLC chomatogram of SCI+ALClowgroup; D: HPLC chomatogram of SCI+ALCmediumgroup; E: HPLC chomatogram of SCI+ALChighgroup; F: HPLC chomatogram of Standard ALC

2.4 脊髓組織TUNEL染色

根據(jù)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取最佳劑量ALC(300 mg/kg)為給藥劑量，進(jìn)行凋亡實(shí)驗(yàn)。TUNEL染色結(jié)果顯示：術(shù)后第7日，各組脊髓損傷組織均內(nèi)可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色的TUNEL陽(yáng)性顆粒，假手術(shù)組偶見(jiàn)陽(yáng)性顆粒。與Sham組比較，SCI組神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高(由 7.13%±1.39% 增加到 39.10%±8.77%，P< 0.01)；而ALC干預(yù)后，細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低 (18.75%±9.45%，P<0.05，圖2)。結(jié)果提示，ALC可抑制損傷節(jié)段脊髓組織中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

Fig.2Apoptosis index in rats(n=3)

*P<0.05，**P<0.01vsSCI group

2.5 脊髓組織HE染色結(jié)果

第42日處死大鼠，各組隨機(jī)取大鼠3只，灌注取材后行HE染色。Sham組鏡下可見(jiàn)脊髓組織結(jié)構(gòu)正常，灰色和白色的交界清楚，神經(jīng)元輪廓清楚，細(xì)胞體大，核仁清晰可見(jiàn)，胞質(zhì)均勻深染。脊髓中央管及血管的形態(tài)顯示正常，無(wú)神經(jīng)元凋亡或者膠質(zhì)細(xì)胞增生的現(xiàn)象。SCI組鏡下部分神經(jīng)元細(xì)胞核固縮或者細(xì)胞質(zhì)染紅現(xiàn)象，觀察到大量的紅細(xì)胞和炎細(xì)胞，出現(xiàn)局灶性壞死的現(xiàn)象，尼氏體溶解消失、核固縮變小，局部細(xì)胞有空泡形成，神經(jīng)原纖維扭曲變形。ALC大劑量治療組鏡下觀察仍可見(jiàn)紅細(xì)胞和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞輕度腫脹，部分核仁顯示不清，胞質(zhì)均勻，較SCI組神經(jīng)元損傷及組織病理變化得到明顯改善(圖3，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅰ)。

3 討論

脊髓損傷是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病，以高致殘率和病死率為其主要特點(diǎn)[2,10]，且有逐年上升的趨勢(shì)。脊髓損傷后可引發(fā)中樞神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生一系列細(xì)胞和分子事件，包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡和細(xì)胞壞死。除了損傷部位不可逆的原發(fā)性損傷外，繼發(fā)性損傷在其損傷后扮演著重要角色[11]，主要包括組織充血水腫、脂質(zhì)過(guò)氧化、微循環(huán)障礙、興奮性氨基酸毒性、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等[12]。如何有效的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)脊髓損傷后的繼發(fā)性損傷至關(guān)重要。

多項(xiàng)研究已表明，氧化應(yīng)激在急性脊髓損傷后急性期及后續(xù)的繼發(fā)性改變中發(fā)揮著重要作用。急性脊髓損傷后氧化應(yīng)激反應(yīng)十分明顯，急性脊髓損傷后，細(xì)胞能量代謝紊亂，致使線粒體產(chǎn)生過(guò)量活性氧(ROS)，ROS類物質(zhì)并作用于細(xì)胞膜，使核酸、蛋白和脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而增加細(xì)胞膜的通透性以及損壞膜的結(jié)構(gòu)，造成胞內(nèi)大量Ca2+積聚，最終導(dǎo)致細(xì)胞水腫以及毒性反應(yīng)，造成大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而加重二次繼發(fā)性損害。除此，炎癥在脊髓損傷的發(fā)病過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，局部損傷組織的炎性反應(yīng)可加重繼發(fā)性脊髓損傷的程度[13]。而且在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)大量ROS激活并啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死。因此，研究如何抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)意義重大。

目前，對(duì)脊髓損傷已進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究，也采用了手術(shù)、藥物、免疫療法等多種治療方法的嘗試，但臨床治療效果依然不佳，這使得對(duì)脊髓損傷的研究任重而道遠(yuǎn)。ALC是一種強(qiáng)抗氧化劑，具有促進(jìn)脂肪代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)能量、抗氧化、抑制炎癥和凋亡等多種重要生物學(xué)功能，而且較易通過(guò)血-腦屏障到達(dá)神經(jīng)中樞。臨床已應(yīng)用于肝臟疾病、心血管疾病以及男性不育癥等方面的治療，也有實(shí)驗(yàn)資料提示ALC具有神經(jīng)保護(hù)作用[14-16]。但對(duì)ALC神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制研究報(bào)道較少。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同劑量ALC干預(yù)脊髓損傷大鼠，觀察其對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，為臨床應(yīng)用ALC治療脊髓損傷進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們得出，ALC能明顯促進(jìn)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，其中以中高劑量組(300 mg/kg)效果最佳。本研究結(jié)果提示，ALC可明顯減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。