傅艷菲， 李 樂， 童盛強(qiáng)， 顏繼忠

(1．浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院藥劑10級本科生， 2. 藥學(xué)院， 浙江 杭州 310014)

病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)是兒童及青壯年階段心血管系統(tǒng)常見病,常因柯薩奇病毒B3(Coxsackie virus B3,CVB3)感染誘發(fā),臨床病情程度不一，部分患者病情危重、可進(jìn)展為擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)，嚴(yán)重危害健康[1]。心肌纖維化(myocardial fibrosis, MF)貫穿VMC病程的各個時期,尤其在慢性病毒性心肌炎(chronic viral myocarditis,CVMC)時期。采用心肌肌球蛋白誘導(dǎo)的免疫性心肌炎動物模型發(fā)病機(jī)制同病毒性心肌炎慢性期(免疫損傷期)相似[2]。不少研究表明，MF逐漸加重是CVMC向DCM發(fā)展的重要病理過程,也是CVMC患者心力衰竭發(fā)作和心源性猝死的重要原因。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1) 是促發(fā)MF病理過程最重要的因子之一,能活化下游Smads蛋白家族,影響細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)， TGF-β1/ Smad 信號通路的過度激活在誘發(fā)并加重 VMC MF病理過程中起重要作用[1,3]。目前，雖然臨床治療MF,以卡托普利(captopril,Cap)等抗血管緊張素類藥物為主要手段，取得一定的近期療效[3]；但深入研究對抗MF的有效藥物，對防止其病情發(fā)展并改善患者生活質(zhì)量有重要意義。

貫葉連翹，其主要活性成分是金絲桃素，偽金絲桃素等[4]。本研究室前期研究顯示，貫葉連翹提取物(hypericum perforatum extract，HPE)中提取的金絲桃具有非常顯著的保護(hù)心肌細(xì)胞和抑制柯薩奇病毒復(fù)制的作用，它可以抑制心肌細(xì)胞凋亡及Fas/FasL 蛋白表達(dá)[5]。HPE尚未見對VMC慢性期MF影響的報道。本研究通過建立實驗性免疫性心肌炎心肌纖維化(myocardial fibrosis of experimental autoimmune myocarditis,MFEAM)的模型，以Cap 做陽性對照，觀察HPE對MFEAM的治療作用及其初步機(jī)制，為今后開發(fā)該藥提供基礎(chǔ)動物學(xué)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器

健康6周齡體重16 g～19 g Balb/c 小鼠雄性70只,(購自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，實驗動物許可證號:SCXK(浙) 2014-0025)，小鼠在實驗室環(huán)境下飼養(yǎng)一周，7周齡時開始實驗。貫葉連翹提取物(hypericum perforatum extract，HPE)，為本校藥學(xué)院中藥實驗室提供，金絲桃素含量≤0.3%；卡托普利(Cap)片，常州制藥廠有限公司，批號161104；豬心肌球蛋白(batch number：0721) 及完全弗氏佐劑：Sigma公司；血清Ⅰ型、III 型膠原ELISA試劑盒,聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)試劑盒,上海匯萊生物科技有限公司；TGF-β1-ELISA試劑盒：深圳晶美公司;TGF-β1單克隆抗體，β-actin 抗體,美國 Santa Cruz 公司; 羊抗小鼠二抗購自武漢博士德公司;紫外分光光度計：恒泰科技有限公司；低溫離心機(jī)：Heraeus，LDZ5-2；AL-104電子分析天平：梅特勒；EC250-90 型電泳儀、DYY—III 型電泳槽，北京市六一儀器廠;光學(xué)顯微鏡：昆山超聲儀器有限公司；Qwin圖像分析軟件(德國Leica)。

1.2 MFEAM模型制備、分組及處理

小鼠隨機(jī)分為正常對照組(n=10)，MFEAM組(n=60)：MFEAM組小鼠實驗第1日，Balb/C小鼠在雙側(cè)腹股溝i.h豬心肌肌球蛋白乳化液0.1 ml(乳化液濃度為1 mg/ml);實驗第七日，在Balb/C小鼠相同部位i.h相同劑量的乳化液，進(jìn)行再次免疫。正常對照組：在同一時間，在小鼠的相同部位i.h等量的生理鹽水。小鼠每周稱重2次，并記錄；觀察小鼠飲食量以及活動度、整體形態(tài)、精神狀態(tài)、皮毛光澤度及死亡情況等。實驗第60日，正常對照組中小鼠全部存活； MFEAM模型組中小鼠存活53只，死亡7只。然后再將MFEAM模型組小鼠按體重隨機(jī)分為: MFEAM模型組(n=14)、HPE100 mg/kg組(n=13)、HPE 40 mg/kg組(n=13)、Cap 50 mg/kg對照組(n=13)。各組藥物每次均分別以 0.4 ml生理鹽水溶解,采用灌胃給藥方式，每天2次，共60 d;正常對照組(n=10))，MFEAM模型組按上述方法同體積同療程給予生理鹽水。

1.3 標(biāo)本采集

實驗第120日，每組分別隨機(jī)取10只小鼠，摘眼球取血,分離出血清于-20℃凍存?zhèn)溆谩?取心臟組織分為 2 部分,分別于 10% 中性甲醛磷酸鹽緩沖液(PBS) 中固定及液氮凍存后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱保存。

1.4 小鼠心臟指數(shù)、脾臟指數(shù)

將取血后的小鼠處死，無菌條件下取出小鼠心臟和脾臟，冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，電子天平稱重并記錄。將心臟、脾臟重量與小鼠體重相比，計算出小鼠心臟重量/體重、脾臟重量/體重的比值。

1.5 小鼠血清PINP、PIIINP、TGF-β水平的ELISA檢測

采用 ELISA 法,分別測定小鼠血清PINP、PIIINP、TGF-β水平,嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.6 小鼠心臟膠原纖維 Masson 染色及膠原容積分?jǐn)?shù)測定

心肌組織常規(guī)Masson染色，膠原纖維染藍(lán)色,胞核染藍(lán)色,胞質(zhì)染紅色。 采用Leica照相系統(tǒng)獲取圖像，盲法分析每張切片5 個視野,測定膠原纖維藍(lán)色面積, 膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)，CVF= 膠原藍(lán)色面積/ 全視野面積×100%,并計算均值。

1.7 Western blot測定心肌組織TGF-β1蛋白

取各組小鼠0.1 g心肌組織提取蛋白，用BCA 法蛋白定量。取各組小鼠蛋白樣品進(jìn)行 SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后以牛血清蛋白封閉1 h。TGF-β1一抗4℃孵育過夜, Tris 緩沖液洗 4 次,電化學(xué)發(fā)光法(ECL) 暗室內(nèi)發(fā)光顯色。用Qwin圖像分析軟件分析測定各帶的灰度值， 用TGF-β1蛋白條帶與β-actin 條帶的比值代表TGF-β1表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 HPE對小鼠一般狀況及死亡率的影響

HPE或Cap治療期間，正常對照組小鼠表現(xiàn)正常無死亡，MFEAM模型組小鼠體重下降，精神萎靡，活動量減少，皮毛色澤度減低，死亡3只 (死亡率 21.42%)；給藥組中，HPE低劑量或Cap組中一般狀況較MFEAM模型組小鼠緩解，各有2只小鼠死亡(死亡率 15.38%)，HPE高劑量組無死亡。治療期間組間死亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(X2= 1.231,P=0.612)

2.2 HPE對小鼠心臟重量/體重(HW/BW)、脾臟重量/體重(SW/BW)的影響

MFEAM模型組小鼠，HW/BW和 SW/BW比值升高，與正常對照組比較差異顯著(P<0.01)，用HPE和Cap治療后，均能抑制HW/BW和 SW/BW比值升高,HPE的作用效果與其劑量有關(guān),且Cap組效果較好, 結(jié)果如表1所示。

GroupHW/BWSW/BWControl4.43±0.2744.68±3.18Model5.31±0.43?54.16±4.47?Model+HPE(40 mg/kg)5.06±0.49#47.16±3.21#Model+HPE(100 mg/kg)4.74±0.43##46.54±2.93##Model+Cap(50 mg/kg)4.67±0.46##46.49±3.02##

HW/BW: Heart weigh/body weight; SW/BW: Spleen weight/body weight; HPE: Hypericum perforatum extract; Cap: Captopril

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsIso model group

2.3 HPE對各組小鼠心肌膠原纖維 Masson 染色及 CVF 的影響

經(jīng)Masson染色后，小鼠正常心肌組織呈橘紅色，膠原纖維呈藍(lán)色。對照組小鼠可見心肌細(xì)胞規(guī)整，其間散在少量藍(lán)色膠原纖維。MFEAM模型組小鼠血管周圍及細(xì)胞間可見大量藍(lán)色膠原纖維，CVF顯著增加；HPE或Cap治療組小鼠心肌組織藍(lán)色膠原纖維程度及CVF，與MFEAM模型組小鼠比較，不同程度地減少，心肌細(xì)胞形態(tài)排列亦見規(guī)整，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05,圖 1,表 2) 。

Fig.1Comparison of myocardial tissue with Masson staining in each group of mice (×100)

GroupCVFTGF-β1 (pmol/ml)Control0.79±0.10 42.84±7.63Model5.20±0.41?74.05±7.53?Model+HPE(40 mg/kg)5.03±0.52#61.18±5.13#Model+HPE(100 mg/kg)4.74±0.35##56.59±4.20##Model+Cap(50 mg/kg)4.62±0.47##54.47±4.83##

HPE: Hypericum perforatum extract; Cap: Captopril

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsIso model group

2.4 HPE對各組小鼠血清PINP、PIIINP、TGF-β1的ELISA檢測結(jié)果的影響

ELISA檢測結(jié)果顯示，MFEAM模型組小鼠的血清PINP、PIIINP、TGF-β1水平與正常對照組相比較明顯增多,兩者具有顯著性差異(P<0.05)；而HPE高、低劑量和Cap治療后,與MFEAM模型組相比較，PINP、PIIINP、TGF-β1水平明顯減少, 與MFEAM模型組比較差異有顯著性意義(P<0.05，表2，表3)。

GroupPINPPIIINP Control1.76±0.3722.21±7.51Model3.58±0.41?38.16±7.87?Model+HPE(40 mg/kg)2.13±0.42#31.12±6.36?#Model+HPE(100 mg/kg)1.97±0.36#27.47±7.41?#Model+Cap(50 mg/kg)1.91±0.44##26.59±6.47?##

HPE: Hypericum perforatum extract; Cap: Captopril

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsIso model group

2.5 HPE對各組小鼠心肌TGF-β1蛋白水平的影響

圖2顯示，與對照組比較, MFEAM模型組TGF-β1 表達(dá)上調(diào)(0.89±0.17vs0.18±0.05;P< 0.01);各治療組TGF-β1的表達(dá)水平均有不同程度下調(diào),HPE大、小劑量，Cap組與MFEAM模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (0.65±0.13,0.46±0.09,0.34±0.08vs0.89±0.17,P<0.05或P<0.01)。

A: Control group; B: Model group; C: Model+HPE 40 mg/kg; D: Model+HPE 100 mg/kg; E: Model+Cap 50 mg/kg

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3 討論

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是指在病理情況下，心肌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM )合成和降解失衡，各類膠原成分比例失調(diào)、排列紊亂及心肌成纖維細(xì)胞大量增生，ECM過度沉積，誘發(fā)心肌收縮舒張功能損害，最終可誘發(fā)心力衰竭。MF可繼發(fā)于多數(shù)心血管疾病，如心肌炎、慢性高血壓、心肌梗死等，也是心室重構(gòu)組織學(xué)典型表現(xiàn)之一[5,6]。目前，藥物研發(fā)人員正在積極探尋能夠?qū)筂F的有效藥物。

本實驗通過豬心肌肌球蛋白，免疫Balb/C小鼠建立MFEAM模型，是目前實驗研究心肌炎和擴(kuò)張型心肌病的主要動物模型，制作簡單，死亡率低，避免其他感染；出現(xiàn)心肌炎約21 d后，炎癥反應(yīng)減退，逐漸產(chǎn)生較多膠原纖維，沉積于心肌組織的細(xì)胞外基質(zhì)中，出現(xiàn)MF[7]。本實驗顯示，在造模期間，MFEAM組小鼠與正常對照組小鼠比較，體重下降，活動量減少，皮毛色澤度減低，小鼠心臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均升高，說明MFEAM模型組小鼠慢性期可能心肌損害纖維化程度加大,脾臟免疫反應(yīng)性升高，同時心肌Masson染色藍(lán)染面積增多，CVF加大，提示小鼠MF模型構(gòu)建成功；而HPE高劑量組，低劑量組和Cap組，與MFEAM模型組相比，上述指標(biāo)數(shù)值均不同程度下降，表明HPE和Cap對免疫反應(yīng)性及慢性MF有治療作用。

心肌膠原纖維最主要的成分是I型和III型膠原蛋白，在慢性心肌炎轉(zhuǎn)化為MF時，I、III型膠原蛋白的合成和表達(dá)過程失控、異常沉積，使心肌細(xì)胞中I型和III型膠原蛋白的含量增加[8]。PINP, PIIINP分別是心臟Ⅰ、Ⅲ型膠原的前體多肽 ,I、III型膠原蛋白的合成和降解可以通過PINP, PIIINP敏感地反映出來，其中I型膠原的降解主要由PINP反映 , 而Ⅲ型膠原的合成主要由PIIINP反映[9]。實驗結(jié)果顯示，MFEAM組小鼠血清PINP、PIIINP含量與正常對照組相比較明顯增多，差異有顯著性意義(P<0.05)；而HPE高、低劑量和Cap治療后,PINP、PIIINP含量明顯減少, 與MFEAM模型組差異有顯著性意義(P<0.05)。表明HPE和Cap能抑制MF，Cap的作用與文獻(xiàn)報道一致[10]。 心肌中膠原過度沉積是因膠原生成大于降解所致,膠原生成和降解之間動態(tài)平衡受許多調(diào)控因子作用，TGF-β是細(xì)胞外間質(zhì)的重要調(diào)控因子，它是包羅多種細(xì)胞因子的超家族, TGF-β1是當(dāng)前公認(rèn)的MF調(diào)控因子，被認(rèn)為能強(qiáng)勁促纖維化, 主要由心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞分泌；可刺激心臟成纖維細(xì)胞中I、111型膠原基因的表達(dá),也調(diào)節(jié)其膠原酶活性,減少膠原降解，還可激活腎素血管緊張素系統(tǒng)的表達(dá)〔10〕。近年來，很多證據(jù)顯示TGF-β1能夠介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞活化成纖維細(xì)胞，參與器官纖維化的發(fā)生發(fā)展；很多心肌損傷因素均能刺激其升高，通過經(jīng)典TGF-β1/smad通路、或者TGF-β1/non-smad通路(如TGF-β1/RhoA)， 活化核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞表型和功能的改變；共同促進(jìn)MF 的發(fā)生發(fā)展〔11，12〕。有報道，干擾 TGF-β1/Smad 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),由其介導(dǎo)的膠原纖維蛋白表達(dá)水平亦下調(diào)〔13〕。本研究顯示,應(yīng)用HPE或Cap治療后,血清TGF-β1濃度下降,同時心肌組織TGF-β1蛋白表達(dá)均有不同程度的下調(diào)，提示 TGF-β1 可能是HPE或Cap抗MF的作用靶點。Cap的作用與相關(guān)文獻(xiàn)觀點一致[10]。通過與以往文獻(xiàn)[5]比較與分析，HPE對小鼠免疫性心肌炎的治療作用，與抑制小鼠脾臟組織,降低外周血T淋巴細(xì)胞CD4/CD8比例和血清肌球蛋白自身抗體滴度有關(guān)。結(jié)合本實驗結(jié)果，可看出HPE還可以通過對TGF-β1/ Smad或TGF-β1/non-smad信號通路的調(diào)控改善MFEAM。

綜上所述，HPE能有效治療小鼠MF。小劑量和高劑量HPE可以減輕MFEAM小鼠MF程度，并降低MFEAM小鼠血清中TGF-β1及PINP、PIIINP含量，下調(diào)MFEAM小鼠心肌組織中TGF-β1的表達(dá)水平；其作用機(jī)制可能與HPE減少膠原蛋白沉積,抑制TGF-β1/smad通路或TGF-β1/non-smad信號通路而干擾免疫性MF有關(guān)。