撒 琪 任貴生 徐孝東 郭錦洲 陳文萃 趙 亮 劉志紅 黃湘華

系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性(AL)，是由單克隆免疫球蛋白輕鏈錯誤折疊形成淀粉樣蛋白在組織器官沉積，造成組織結(jié)構(gòu)破壞、器官功能障礙并進行性進展的疾病[1]?？衫奂叭矶鄠€器官，臨床表現(xiàn)多樣，預(yù)后差，臨床診斷主要依賴于組織活檢[2-4]。單克隆免疫球蛋白主要來源于骨髓中異?？寺⌒詽{細胞，利用多參數(shù)流式細胞術(shù)(multiparametric flow cytometry，MFC)檢測AL患者骨髓漿細胞，識別惡性漿細胞對疾病的診斷和治療具有重要意義，且相對于組織活檢，骨髓穿刺創(chuàng)傷較小。目前，AL單克隆漿細胞表型特征，不同漿細胞病之間漿細胞數(shù)量與免疫表型差異尚未十分明確，缺乏大樣本研究。

本研究回顧性觀察AL患者的臨床特征，利用MFC對骨髓漿細胞進行檢測，通過比較AL與非AL的具有腎臟意義的單克隆免疫球蛋白血癥(MGRS)、MM患者骨髓漿細胞數(shù)量及表型差異，分析AL單克隆漿細胞數(shù)量、免疫表型特征，探究兩者與疾病風(fēng)險分層的關(guān)系。

對象和方法

研究對象2015年5月至2018年9月在東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心住院治療的AL患者119例，對照組非AL的MGRS患者 49例，MM患者 19例。所有患者均有以下表現(xiàn)：(1)存在蛋白尿和(或)腎功能不全[估算的腎小球濾過率(eGFR)<60 ml/(min·1.73m2)]；(2)血液/尿液/組織中檢出單克隆免疫球蛋白或骨髓檢查發(fā)現(xiàn)漿細胞異常增生。

臨床及實驗室指標(biāo)收集患者性別、年齡、24h尿蛋白、血白蛋白、球蛋白、尿素氮、血清肌酐、尿酸、堿性磷酸酶、白細胞、血紅蛋白、血小板、免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)、血游離輕鏈差值(dFLC)、N-末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)、肌鈣蛋白T(TnT)、血免疫固定電泳等實驗室檢查結(jié)果及器官受累情況。

相關(guān)定義AL及器官受累診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性診斷和治療指南》(2016年)[1]，腎臟：24h尿蛋白定量>0.5g，以白蛋白為主；心臟：心臟超聲平均心室壁厚度>12 mm，排除其他心臟疾?。换蚴窃跓o腎功能不全及心房顫動時NT-proBNP>332 ng/L；肝臟：無心力衰竭時肝上下徑(肝叩診時鎖骨中線上測量的肝上界到肝下界的距離)>15 cm；或堿性磷酸酶大于正常值上限的1.5倍；外周神經(jīng)：臨床出現(xiàn)對稱性雙下肢感覺運動神經(jīng)病變。MGRS診斷參考相關(guān)文獻[5-6]，多發(fā)性骨髓瘤(MM)診斷參考《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2017年修訂)》[7]。

研究方法

儀器與試劑MoFlo XDP超速流式細胞分選系統(tǒng)(Beckman Coulter公司)，配置488 mm和633 mm激光器，采用六色熒光標(biāo)記技術(shù)，用RPE-TR、APC、APC-Cy7、RPC-Cy7、CD117-UV1、RPE-Cy5分別標(biāo)記胞膜CD19、CD38、CD45、CD56、CD117、CD138抗體。熒光標(biāo)記的κ和λ游離輕鏈抗體。以上試劑及溶血素、細胞固定液和透膜液均購自Beckman Coulter公司。

樣品制備無菌操作抽取患者骨髓液，取0.2 ml涂片進行骨髓形態(tài)學(xué)檢測；另取2 ml于肝素抗凝管中4℃低溫保存，于48h內(nèi)進行紅細胞裂解，CD19、CD38、CD45、CD56、CD117、CD138、κ和λ抗體染色處理待測。

形態(tài)學(xué)檢測骨髓涂片經(jīng)瑞氏—吉姆薩染色，光鏡下觀察并分類計數(shù)200個有核細胞。

MFC檢測用流式細胞儀(MoFlo XDP，Beckman Coulter公司)分析樣品。每次記錄至少10萬個細胞。用BD CellQuest Pro軟件對數(shù)據(jù)進行分析。根據(jù)前向散射(FSC)和側(cè)向散射(SSC)指定骨髓有核細胞的閾值門控以排除紅細胞，死細胞和細胞碎片。采用CD38/CD138設(shè)門策略圈定雙陽性細胞，分析該群細胞其他表面抗原的表達情況。

統(tǒng)計學(xué)分析使用《SPSS18.0》軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)(四分位間距)表示，計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示。計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一般資料本研究納入AL患者119例，男性61例，女性58例，中位年齡55歲。對照組納入非AL的MGRS 49例(包括伴單克隆免疫球蛋白沉積的增生性腎小球腎炎27例，單克隆免疫球蛋白沉積病16例，輕鏈沉積病3例，重鏈沉積病2例，輕重鏈型淀粉樣變性1例)，MM 19例。所有患者基線臨床特征見表1。

表1 三組患者臨床基線資料

AL：系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性；MGRS：具有腎臟意義的單克隆免疫球蛋白血癥；MM：多發(fā)性骨髓瘤；dFLC：游離輕鏈差值；NT-proBNP ：N-末端腦鈉肽前體；TnT：肌鈣蛋白T；P1：AL組vs非AL的MGRS組；P2：AL組vsMM組

漿細胞數(shù)量特征AL患者骨髓形態(tài)學(xué)檢測總漿細胞比例2%(0.5%，4%)，MFC檢測總漿細胞比例0.61%(0.3%，1.21%)，其中單克隆漿細胞比例0.42%(0.07%，0.99%)。無論是形態(tài)學(xué)檢測還是MFC檢測，AL患者骨髓漿細胞數(shù)量高于MGRS(P<0.001)，低于MM(P<0.001)；MFC檢測單克隆漿細胞數(shù)量也呈現(xiàn)上述規(guī)律(表2)。

表2 3組患者漿細胞數(shù)量及單克隆漿細胞抗原表達情況

AL：系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性；MM：多發(fā)性骨髓瘤；MGRS：具有腎臟意義的單克隆免疫球蛋白血癥；MFC：多參數(shù)流式細胞術(shù)；P1：AL組vs非AL的MGRS組；P2：AL組vsMM組

漿細胞免疫表型特征119例AL患者中有96例(80.7%)檢測出輕鏈限制性，其中83例(86.5%)限制性表達λ輕鏈，單克隆漿細胞免疫表型主要為CD19-(89.6%，86/96)、CD56+(71.9%，69/96)、CD117-(53.1%，51/96)。

與MM、MGRS相比，AL單克隆漿細胞表面CD117陽性率明顯較高(P=0.001)；且限制性表達λ輕鏈更為顯著(P=0.002)(表2)。此外，與MGRS相比，AL單克隆漿細胞表達CD19的比例更低(P<0.001)。

AL患者單克隆漿細胞數(shù)量與免疫表型的相關(guān)性分析根據(jù)單克隆漿細胞表面CD19、CD56、CD117抗原分子表達情況對漿細胞數(shù)量進行分組比較，發(fā)現(xiàn)CD19陰性組患者MFC檢測骨髓漿細胞數(shù)量為0.77%(0.42%，1.43%)，明顯高于CD19陽性組0.36%(0.16%，0.83%)(P=0.013)(表3)。CD56、CD117組內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 AL患者單克隆漿細胞數(shù)量與免疫表型的相關(guān)性

AL：系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性；MFC：多參數(shù)流式細胞術(shù)

AL疾病風(fēng)險分層與漿細胞數(shù)量、免疫表型的關(guān)系根據(jù)Mayo分期系統(tǒng)(修訂版)[8]，將AL淀粉樣變性患者分為Ⅰ～Ⅳ期。MFC檢測單克隆漿細胞比例最高的為Ⅳ期0.98%(0.6%，1.37%)，最低為Ⅱ期0.53%(0.29%，1.03%)Ⅳ期與Ⅱ期兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.033)；而形態(tài)學(xué)檢測四組患者骨髓漿細胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表4)。比較單克隆漿細胞表面抗原表達情況，CD117在Ⅰ～Ⅳ期患者中的陽性率分別為61.3%、33.3%、30.8%、75%。CD117在Ⅳ期患者中陽性率明顯高于Ⅱ、Ⅲ期患者(P=0.032，P=0.021)；在Ⅰ期患者中比例也較高，與Ⅱ期患者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.029)。

表4 AL患者Mayo分期(修訂版)[8]與單克隆漿細胞抗原表達情況

AL：系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性；MFC：多參數(shù)流式細胞術(shù)

討 論

AL是一種漿細胞疾病，其特征是骨髓中存在一群產(chǎn)生κ或λ輕鏈的克隆性漿細胞，其過度產(chǎn)生錯誤折疊的免疫球蛋白輕鏈形成不溶性纖維在組織器官沉積，從而對機體造成損害[9]。單克隆漿細胞準(zhǔn)確識別和特異性表型分析對AL淀粉樣變性的疾病診斷、療效和預(yù)后評估具有重要作用。由于異常克隆的漿細胞數(shù)量少，形態(tài)變化小，且與正常漿細胞共存，用傳統(tǒng)的骨髓涂片形態(tài)學(xué)檢測很難識別[10]。MFC免疫表型分析已經(jīng)廣泛應(yīng)用于白血病、淋巴增殖性疾病的診斷和監(jiān)測[9]，在MM中有較為成熟的應(yīng)用。近年來越來越多的研究關(guān)注到在MFC在AL型淀粉樣變性中的潛在價值，免疫表型分析與輕鏈限制性檢測可有效識別惡性漿細胞，輔助臨床診斷。但是，目前尚缺乏大樣本的研究，關(guān)于克隆性漿細胞的數(shù)據(jù)尤其是免疫表型特征的數(shù)據(jù)仍然有限，未能明確定義AL單克隆漿細胞免疫表型譜；免疫表型與患者臨床特征、疾病進展風(fēng)險及預(yù)后的關(guān)系有待深入探索。

本研究共收集119例AL、49例非AL的 MGRS、19例MM患者骨髓進行MFC檢測。AL患者中有96例(80.7%)檢測到漿細胞輕鏈限制性，其中83例(86.5%)限制性表達λ輕鏈；對比免疫固定電泳結(jié)果119例AL患者有71例(59.7%)檢測到單克隆條帶，MFC檢測漿細胞輕鏈限制性靈敏度明顯更高(P<0.001)。AL單克隆漿細胞免疫表型主要為CD19-(89.6%，86/96)、CD56+(71.9%，69/96)、CD117-(53.1%，51/96)。與Hu等[11]報道51例AL患者CD117陽性率為68.6%略有不同的是，本研究中CD117的陽性率僅46.9%，超過一半的患者(53.1%)骨髓單克隆漿細胞CD117為陰性。與MM、MGRS患者相比，AL患者骨髓單克隆漿細胞表面CD117的陽性率更高。CD117是具有酪氨酸激酶活性的造血生長因子受體，正常骨髓漿細胞一般不表達CD117。以往研究發(fā)現(xiàn)在MM中CD117陽性與良好的預(yù)后相關(guān)[12-14]。在AL淀粉樣變性中，CD117是否與預(yù)后相關(guān)尚需進一步的探究。

漿細胞數(shù)量對于AL型淀粉樣變性的疾病診斷和預(yù)后評估也具有重要意義。對比AL、MM、非AL的 MGRS三組間的漿細胞負(fù)荷，無論是形態(tài)學(xué)檢測還是MFC檢測，AL骨髓漿細胞數(shù)量高于MGRS而低于MM；MFC檢測單克隆漿細胞數(shù)量同樣是AL高于非AL的 MGRS而低于MM。這一結(jié)果與Diao等[15]的研究一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)單克隆漿細胞CD19表達缺失的患者骨髓漿細胞數(shù)量高于表達CD19的患者(P=0.013)，提示CD19缺失的單克隆漿細胞惡性程度高于CD19陽性單克隆漿細胞。CD19是表達與B淋巴細胞及濾泡樹突狀細胞的表面蛋白，在B細胞成熟并最終分化為漿細胞的整個過程中都有表達[16]。CD19是B細胞受體(B cell receptor，BCR)復(fù)合體的組成之一，發(fā)揮降低B細胞分裂及分化所必需的抗原濃度閾值的作用[17]。正常漿細胞通常表達CD19，在一項685例MM的研究中發(fā)現(xiàn)只有4%的患者表達CD19[18]。因此，CD19可作為鑒別正常與異常漿細胞的標(biāo)志。另一項研究發(fā)現(xiàn)在MM中CD19缺失與疾病進展相關(guān)[19]。但CD19在AL中是否與疾病進展相關(guān)尚無報道。

為進一步探究漿細胞數(shù)量、免疫表型與疾病風(fēng)險分層之間的關(guān)系，本研究根據(jù)2012年Mayo分期系統(tǒng)對AL患者進行分組[8]。 MFC檢測單克隆漿細胞數(shù)量最高的為Ⅳ期患者，揭示疾病風(fēng)險等級高的患者漿細胞負(fù)荷高，且相較于數(shù)量最低的Ⅱ期患者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.033)；而形態(tài)學(xué)檢測漿細胞數(shù)量在4組患者中未能發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。提示通過MFC檢測AL患者骨髓中單克隆漿細胞數(shù)量可預(yù)測患者的疾病風(fēng)險。有趣的是，不同分期患者CD117呈現(xiàn)差異表達，在Ⅰ期和Ⅳ期患者陽性率較高。

本研究尚存在不足之處：(1)對照組納入的MM病例數(shù)相對不足，在疾病間比較時可能存在偏倚；(2)僅從橫斷面分析漿細胞數(shù)量及表型特征，缺乏治療后的監(jiān)測；(3)對患者觀察隨訪時間短，不同表型患者生存及預(yù)后是否存在差異尚需進一步探究。

小結(jié)：利用MFC可有效測定AL患者骨髓中漿細胞數(shù)量，識別漿細胞克隆性。對單克隆漿細胞數(shù)量的檢測和免疫表型的分析在AL的診斷、鑒別診斷與疾病風(fēng)險評估中具有重要意義，有極大的臨床應(yīng)用價值。