唐曉桐,曲笑鋒,于艷輝,王寶成,張文恒,徐 建

（1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司，吉林省中藥標準化關(guān)鍵工程技術(shù)重點實驗室，長春130103；2.通藥制藥集團股份有限公司，通化134000）

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

養(yǎng)脾丸，黃棕色丸，由通藥制藥集團股份有限公司提供，批號：170306；多潘立酮片，白色，10mg/粒，西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)，批號170324550；四君子顆粒，棕色顆粒，15g/袋，葵花藥業(yè)集團湖北武當有限公司生產(chǎn)，批號1705010。實驗前養(yǎng)脾丸研磨成粉，0.4%羧甲基纖維素鈉配置成混懸液，濃度分別為0.675、1.35、2.7 g/kg （相當與臨床成人用量的 1、2、4倍），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 動物

SPF級Wistar大鼠70只，雌雄各半，體重200～220g，SPF級ICR小鼠60只，雌雄各半，體重18～22g，購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司。生產(chǎn)許可證編號：SCXK（吉）-2016-0003。

1.3 試劑

醫(yī)用酒精：德州德新康消毒制品有限公司，批號：150809；水合氯醛：國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：T20140725；D-木糖 （D-xylose）ELISA 檢測試劑盒，上海江萊生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：201708；胃泌素（GAS），ELISA檢測試劑盒，上海江萊生物科技有限公司， 生產(chǎn)批號：201708；β-內(nèi)啡肽 （β-EP）ELISA檢測試劑盒，上海江萊生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：201708；胃動素（MTL）ELISA 檢測試劑盒，上海江萊生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：201708；生長抑素（SS）ELISA檢測試劑盒，上海江萊生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：201708；血管活性腸肽（VIP）ELISA 檢測試劑盒，上海江萊生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：201708；IgG ELISA檢測試劑盒，上海江萊生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：201710；IgM ELISA檢測試劑盒，上海江萊生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：201710。

1.4 儀器

酶標儀，廠家：Manufactured in China Designed in California USA，型號：SMP500-18272-LSIO；低溫冷凍離心機，廠家：Thermo Fisher，型號：Primo 型；電子天平，廠家：美國雙杰兄弟有限公司，型號：T1000。

1.5 方法

1.5.1 模型建立及分組給藥

1.5.1.1 胃腸功能檢測[1～2]

將造模大鼠隨機等分為6組：脾虛模型組、多潘立酮組、四君子顆粒組、養(yǎng)脾丸高、中、低劑量組各10只。采用三因素復(fù)合的方法復(fù)制大鼠脾虛模型：a.灌胃大黃（200%、劑量 20g/kg）；b.游泳至力竭（鼻尖沒入水面5s），隔天游泳；c.隔天禁食，共造模21d。造模結(jié)束后，給藥組分別灌胃給予多潘立酮片（2.7mg/kg）、四君子顆粒（4050mg/kg）、養(yǎng)脾丸高（3480mg/kg）、中（1740mg/kg）、低劑量（870mg/kg）藥液，空白對照組、模型對照組灌胃給予蒸餾水，給藥體積為20mL/kg，連續(xù)7d。

1.5.1.2 免疫功能檢測

a.將小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為空白對照組、模型對照組、四君子顆粒組、養(yǎng)脾丸高、中、低劑量組。除空白對照組外，其余5組小鼠以100%大黃煎劑1mL/只灌胃，連續(xù)給藥7d，小鼠出現(xiàn)納呆、食量減少、消瘦體重下降、毛發(fā)豎立、無力倦縮狀，即造模成功。于第8d開始，空白對照組及脾虛模型組分別以0.4%羧甲基纖維素鈉20mL/kg灌胃，其余4組分別給予四君子顆粒 （17550mg/kg）、養(yǎng)脾丸高劑量（6250mg/kg、）中劑量（3750mg/kg）、低劑量（1250g/kg）藥液，連續(xù)7d。b.末次給藥后1h，稱體重，各鼠均按0.1mL/10g劑量由尾靜脈注入印度墨汁 （以生理鹽水按 1：5 稀釋），注射后分別在 1min（t1）、10min（t2）從小鼠眼眶靜脈叢取血20 μL溶于2.0 mL 0.1%Na2CO3溶液中搖勻，放置20min后680 nm處測其吸光度值（A），以0.1%Na2CO3溶液做空白對照。

1.5.2 檢測指標

1.5.2.1 一般狀態(tài)觀察

日常觀察大鼠的自發(fā)活動，大便性狀，逐日記錄攝食量及體重變化情況。

1.5.2.2 血液指標

胃腸功能檢測：末次給藥1h后，腹主動脈采血4 mL，平均置于2只試管中 （其中一支管中加入10%NA-EDTA 及 抑 肽 酶 各 30μL），2000 r/min 離 心 5 min，取上清，-20℃保存?zhèn)溆谩０凑誆LISA檢測試劑盒要求，測定血清 GAS、血清 D-xylose，血漿 β-EP[3]、MTL、VIP、SS[4]。

免疫功能檢測[5～7]：末次給藥1h后，各組小鼠眼球取血，3500 r/min離心15 min，檢測血清中IgM和IgG含量。將小鼠處死后取肝臟、脾臟和胸腺，稱重，根據(jù)公式計算廓清指數(shù)K值和吞噬指數(shù)α值。

式中：t1、t2分別為取血時間；A1、A2分別為在時間t1、t2時所取血樣對應(yīng)的吸光度。

1.5.3 統(tǒng)計分析

采用DAS1.0進行統(tǒng)計分析，將每項指標以均數(shù)±標準差（X±SD）表示。

2 結(jié)果

2.1 對脾虛證大鼠治療作用及對胃腸激素的影響

2.1.1 對大鼠攝食量和體重的影響

采用三因素復(fù)合的方法復(fù)制脾虛模型后，與空白對照組比較，模型組動物逐漸出現(xiàn)便溏、肛門污穢、消瘦、活動逐漸減少、拱背、毛發(fā)干枯無光澤等癥狀。給藥后，各治療組大便逐漸變稠到干，活動增多，毛發(fā)蓬松有光澤接近空白對照組。造模前，各組動物間體重無明顯差異；連續(xù)造模21d后，空白對照組大鼠體重呈正常增長趨勢；與空白對照組比較，造模大鼠體重均增長緩慢，甚至出現(xiàn)負增長，造模結(jié)束后各組體重均低于空白對照組；給藥7天后，與模型組比較 ，除多潘立酮組外其余各給藥組動物體重增長均無明顯差異，各給藥組動物攝食量均無明顯差異，詳見表1。

表1 對大鼠攝食量和體重的影響（X±SD，n=10）

2.1.2 對血清GAS、D-xylose的影響

與空白對照組比較，模型組血清GAS、D-xylose含量明顯降低（P<0.001），與模型組比較，多潘立酮組、四君子顆粒組、養(yǎng)脾丸高、中、低劑量組能增加血清中 GAS 含量（P<0.05，P<0.01，P<0.001），養(yǎng)脾丸中劑量組還可增加D-xylose含量（P<0.05），詳見表2。

表 2 對血清 GAS、D-xylose 的影響（X±SD，n=10）

2.1.3 對血漿 β-內(nèi)啡肽（β-EP）、胃動素（MTL）、生長抑素（SS）、血管活性腸肽（VIP）的影響

與空白對照組比較，模型組血漿β-EP、MTL、SS、VIP 明顯降低（P<0.05、P<0.01），與模型組比較，多潘立酮組、四君子顆粒組、養(yǎng)脾散組、養(yǎng)脾丸高、中、低劑量組能增加血漿 β-EP 含量 （P<0.05，P<0.01，P<0.001）；多潘立酮組、四君子顆粒組、養(yǎng)脾丸中劑量組能增加血漿MTL含量（P<0.05，P<0.01）；多潘立酮組、四君子顆粒組、養(yǎng)脾丸高、低劑量組能增加血漿中SS含量（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；各組對 VIP 無明顯作用，詳見表3。

表 3 對血漿 β-EP、MTL、SS、VIP 的影響（X±SD，n=10）

2.2 對脾虛證小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的影響

2.2.1 對廓清指數(shù)、吞噬指數(shù)的影響

與空白組比較，脾虛證小鼠廓清指數(shù)、吞噬指數(shù)明顯降低（P<0.05，P<0.001）；與模型組比較，多潘立酮組、四君子顆粒組、養(yǎng)脾丸高、中、低劑量組均可明顯提高小鼠廓清指數(shù)（P<0.001）；養(yǎng)脾丸中、低劑量組可明顯提高吞噬指數(shù)（P<0.05），詳見表4。

表4 對廓清指數(shù)、吞噬指數(shù)的影響（X±SD，n=10）

2.2.2 對血清IgG、IgM的影響

與空白組比較，脾虛證小鼠IgG明顯降低 （P<0.001）；與模型組比較，四君子顆粒組、養(yǎng)脾丸中、低劑量組均可明顯提高小鼠血清IgM含量 （P<0.05，P<0.01）；養(yǎng)脾丸中劑量組可明顯提高血清中IgG含量（P<0.01），詳見表 5。

表 5 對小鼠血清 IgG、IgM（X±SD，n=10）

3 討論

建立人類疾病的動物模型，要先找到人類發(fā)病的致病因素，再來創(chuàng)造最能貼近人類發(fā)病的條件，從而使動物患上和人類類似的疾病。因此，找到發(fā)病的病因是建立動物模型的基礎(chǔ)[8]。本實驗采用了復(fù)合多因素造模法成功地制備了脾虛證動物模型，通過灌胃大黃、游泳力竭和隔日禁食多因素共同作用，使大鼠出現(xiàn)脾虛的癥狀，從一般行為狀態(tài)來觀察大鼠，模型組大鼠出現(xiàn)便溏、肛門污穢、消瘦、活動逐漸減少、拱背、毛發(fā)干枯無光澤，對外界的刺激做出的反應(yīng)也不及空白對照組快。同時造模前，各組動物間體重無明顯差異，連續(xù)造模21d后，造模大鼠體重增長緩慢，甚至出現(xiàn)負增長，造模結(jié)束后各組體重均低于空白對照組，且模型組大鼠的攝食量與空白對照組相比，顯著降低（P＜0.001），并且解剖大鼠后，發(fā)現(xiàn)無其他器質(zhì)性病變，說明動物模型建立成功。

枳實消痞丸源自李東垣的《蘭室秘藏》，由半夏瀉心湯合枳術(shù)湯加減而來，原書中記載其“治右關(guān)脈弦，心下虛痞，惡食懶倦，開胃進食”[9]。方中枳實為君藥，功能行氣消痞；厚樸為臣藥，效能除滿下氣；枳實和厚樸相須為用，增加破氣除滿和散痞的功效。佐藥黃連苦寒，效能燥濕清熱；半夏功能消痞散結(jié)；干姜具有溫中散寒、溫肺化飲之功。最后再佐麥芽曲和胃消食；四君子湯益氣健脾，化濕和中；使藥甘草調(diào)和諸藥。全方消補兼用，同調(diào)寒熱，辛開苦降[10]。枳實消痞丸已廣泛應(yīng)用于臨床治療實踐中。

為判斷療效本研究選擇了與胃腸功能和免疫功能息息相關(guān)的指標進行檢測。MTL為消化道激素之一，是由22個氨基酸組成的多肽，分布在全部小腸，其作用是促進和影響胃腸運動及胃腸道對水、電解質(zhì)的運輸。GAS是一種重要的胃腸激素，它主要由G細胞分泌。G細胞是典型的開放型細胞，以胃竇部最多，其次是胃底、十二指腸和空腸等處。近年發(fā)現(xiàn)，頰粘膜、舌、食道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)也含有胃泌素。1978年，Rehfeld[11]證明人的腦脊液和某些腦組織中存在胃泌素，胃泌素幾乎對整個胃腸道均有作用，它可促進胃腸道的分泌功能，增加胃腸道的運動，松弛幽門括約肌、膽道口括約肌和回盲部括約肌，促進胃及上部腸道粘膜細胞的分裂增殖以及促進胰島素和降鈣素的釋放。IgG是血清主要的抗體成分，約占血清Ig的75%～80%[12]。其中 40～50%分布于血清中，其余分布在組織中。IgG是唯一可以通過胎盤的免疫球蛋白。IgG的功能作用主要在機體免疫中起保護作用，大多數(shù)抗菌、抗病毒；應(yīng)對麻疹、甲型肝炎等，能有效地預(yù)防相應(yīng)的感染性疾病。由此可見，MTL、GAS、IgG等相關(guān)指標在胃腸功能和免疫功能中體現(xiàn)出的重要性。研究結(jié)果顯示：胃腸功能檢測中，與空白對照組比較，模型組各指標含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組可使MTL、GAS等大多數(shù)主要指標的含量明顯增加（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。免疫功能檢測中，與空白組比較，脾虛證小鼠廓清指數(shù)、吞噬指數(shù)以及血清 IgG 明顯降低（P＜0.05、P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組均可明顯提高小鼠廓清指數(shù)（P<0.001）；養(yǎng)脾丸中、低劑量組可明顯提高吞噬指數(shù)（P<0.05）；四君子顆粒組、養(yǎng)脾丸中、低劑量組可明顯提高小鼠血清 IgM 含量（P＜0.05、P＜0.01）；養(yǎng)脾丸中劑量組還可明顯提高血清中IgG含量（P＜0.01）。本實驗研究結(jié)論：養(yǎng)脾丸可一定程度調(diào)節(jié)脾虛所致胃腸激素分泌失調(diào)，使相關(guān)指標獲得改善，提升胃腸功能，同時還具有提高機體免疫力的作用。