王悅縈，粟雨芯，李方琳，李凌浩，馬忠仁*

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

抗生素主要是由細(xì)菌、霉菌或其他微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物或人工合成的類(lèi)似物[1]。一般情況下，合理正常的使用抗生素不會(huì)對(duì)其宿主產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用[2-4]。但濫用抗生素，會(huì)導(dǎo)致腸道菌群微環(huán)境失調(diào)，會(huì)對(duì)人體健康造成巨大危害。據(jù)報(bào)道，腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的的不良變化與人類(lèi)的多種疾病相關(guān)，包括慢性炎癥反應(yīng)，II型糖尿病，動(dòng)脈粥樣硬化，慢性腎病，以及精神疾病等[5-7]。本研究通過(guò)建立腸道菌群失衡的小鼠模型，旨在讓人們重視抗生素濫用的危害性，并提醒人們?cè)谝院蟮纳钪泻侠硎褂每股豙8-14]。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所選用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為C57BL/6J小鼠（中國(guó)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所）；所選用的飼料為普通小鼠飼料（南通特洛菲生物有限公司）?？股兀簵U菌肽；慶大霉素；環(huán)丙沙星；新霉素；青霉素；甲硝唑；硫酸鏈霉素；萬(wàn)古霉素；頭孢他啶；上述所用試劑均購(gòu)自阿拉丁生物試劑有限公司。培養(yǎng)基;滅菌無(wú)纖維羊血(北京索萊寶科技有限公司)、瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 適應(yīng)階段 本實(shí)驗(yàn)所用小鼠為六周齡雄性C57BL/6J小鼠（n=14），在12 h光暗循環(huán)的無(wú)特定病原體動(dòng)物房（SPF級(jí)）中飼養(yǎng)，正常飲食一周后開(kāi)始試驗(yàn)。

1.2.2 抗生素破壞小鼠腸道菌群 所有小鼠平均分為兩組，對(duì)照組（n=7）和實(shí)驗(yàn)組（n=7）。對(duì)照組正常飲食和飲水；實(shí)驗(yàn)組小鼠的飲用水為抗生素溶液（具體含量如下: 新霉素100 μg /ml、鏈霉素50 μg /ml、青霉素100 μg /ml，萬(wàn)古霉素 50 μg /ml、甲硝唑100 μg /ml、桿菌肽1 mg/ml、環(huán)丙沙星125 μg /ml、頭孢他啶100 μg /ml,慶大霉素170 μg /ml），并每周更換一次抗生素混合溶液，共4周。試驗(yàn)前后，采集小鼠體重及收集小鼠新鮮糞便。

1.2.3 血平板培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 為確認(rèn)小鼠腸道菌群數(shù)量變化，故做小鼠糞便血平板培養(yǎng)試驗(yàn)。首先收集小鼠的新鮮糞便于經(jīng)過(guò)高壓滅菌的1.5 ml離心管中，然后用無(wú)菌生理鹽水將糞便配制成10%的糞便混合溶液，吸取上清液涂于5%的羊血瓊脂平板上，所有小鼠的糞便血平板均分為有氧和無(wú)氧兩種培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)。最后將所有血平板放置在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后計(jì)算每個(gè)血平板上面的落數(shù)并記錄。

1.2.4 小鼠空腹血糖的測(cè)量 在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的第0天和第30 d，分別對(duì)小鼠進(jìn)行空腹血糖的測(cè)量。所有小鼠在測(cè)量前空腹8 h，用血糖儀測(cè)量并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道菌群失衡后對(duì)小鼠糞便中微生物數(shù)量的影響

在小鼠的腸道內(nèi)有多種微生物，微生物菌落的數(shù)量變化可以顯示抗生素對(duì)小鼠腸道菌群的破壞程度。因此，在實(shí)驗(yàn)的第0天和30天分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的糞便樣品，對(duì)其分別進(jìn)行有氧培養(yǎng)和無(wú)氧培養(yǎng)。結(jié)果如圖所示，圖1、圖2表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在第0天小鼠的糞便樣品，分別取0.1 mg進(jìn)行有氧培養(yǎng)和無(wú)氧培養(yǎng)，并對(duì)其培養(yǎng)12 h，最后對(duì)血平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的小鼠體內(nèi)均有菌落，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。為了對(duì)上述結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，本研究還選取了0.05 mg的糞便樣品進(jìn)行血平板培養(yǎng)，結(jié)果如圖3、圖4所示，結(jié)果同樣顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的小鼠體內(nèi)均有菌落，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。

在第30天，收集的糞便樣品取0.1mg進(jìn)行有氧培養(yǎng)和無(wú)氧培養(yǎng)，并在培養(yǎng)12 h以后對(duì)血平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)（如圖5、圖6）。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的菌落數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。作為對(duì)照，在實(shí)驗(yàn)中稱(chēng)取了0.05 mg的糞便樣品進(jìn)行血平板培養(yǎng)，結(jié)果如圖7、圖8所示，結(jié)果同樣顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的菌落數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。因此，得出結(jié)論，在30天的時(shí)間里，對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠的腸道菌群進(jìn)行抗生素干擾后，小鼠的腸道菌群明顯下降，說(shuō)明抗生素對(duì)小鼠的腸道菌群有破壞作用。圖9表示在30天時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的血平板培養(yǎng)圖，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組血平板培養(yǎng)后肉眼觀(guān)察不到菌落，而對(duì)照組長(zhǎng)出很多菌落，以上數(shù)據(jù)均表明抗生素對(duì)小鼠的腸道菌群有很大的破壞作用。

圖1 0天有氧培養(yǎng)結(jié)果(0.1mg樣本)

圖2 0天無(wú)氧培養(yǎng)結(jié)果(0.1mg樣本)

圖3 0天有氧培養(yǎng)結(jié)果(0.05mg樣本)

圖4 0天無(wú)氧培養(yǎng)結(jié)果(0.05mg樣本)

圖5 30天有氧培養(yǎng)結(jié)果(0.1mg樣本)

圖6 30天無(wú)氧培養(yǎng)結(jié)果(0.1mg樣本)

圖7 30天有氧培養(yǎng)結(jié)果(0.05mg樣本)

圖8 30天無(wú)氧培養(yǎng)結(jié)果(0.05mg樣本)

圖9 30天時(shí)血平板培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 腸道菌群失衡對(duì)小鼠空腹血糖的影響

小鼠在第0天測(cè)得的空腹血糖結(jié)果如圖10所示，通過(guò)Graph pad軟件對(duì)兩組小鼠的空腹血糖進(jìn)行分析，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在第30天對(duì)14只小鼠的空腹血糖再次進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果如圖11所示。通過(guò)Graph pad軟件對(duì)兩組小鼠的空腹血糖進(jìn)行分析，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)兩組結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且實(shí)驗(yàn)組空腹血糖低于對(duì)照組，這種結(jié)果可能與腸道菌群的破壞、菌群代謝產(chǎn)物的變化及腸道消化吸收能力的變化有關(guān)，但具體原因，還應(yīng)該經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。

圖10 0天空腹血糖結(jié)果

圖11 30天空腹血糖結(jié)果（ *：p＜0.05）

3 討論

抗生素飼喂小鼠30天后，無(wú)論經(jīng)過(guò)有氧還是無(wú)氧培養(yǎng)小鼠體內(nèi)的腸道菌群，實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)的腸道菌群數(shù)量均顯著減少，這說(shuō)明不僅是菌群的豐度還是獨(dú)立種屬的數(shù)量，都發(fā)生了顯著的改變，這說(shuō)明小鼠的腸道菌群被破壞。另外，經(jīng)過(guò)抗生素干預(yù)的小鼠的血糖值和對(duì)照組也有顯著差異，這說(shuō)明血液等其他指標(biāo)很有可能由于腸道菌群遭到破壞而發(fā)生了變化，這對(duì)機(jī)體健康會(huì)造成危害。腸道微生物群的組成中的不良變化和多種疾病相關(guān)，包括慢性炎癥反應(yīng)，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，動(dòng)脈粥樣硬化，慢性腎病，以及精神疾病等?？股貫E用是導(dǎo)致這種現(xiàn)象發(fā)生的重要因素。