王大威，張世侖，靖 波，杜 君，景 宏，馬 挺

（1.海洋石油高效開發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100028；2.中海油研究總院有限責(zé)任公司，北京100028；3.中海石油（中國(guó)）有限公司天津分公司，天津300452；4.南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子微生物學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071）

硫酸鹽還原菌（sulfate reducing bacteria，SRB）是一類可以利用硫酸鹽、硫代硫酸鹽乃至單質(zhì)硫作為終端電子受體的厭氧微生物的總稱，以往的研究中所分離的 SRB 約有 18 個(gè)屬 40 多個(gè)種類［1］。SRB也可以在厭氧環(huán)境中利用硝酸鹽、有機(jī)酸等物質(zhì)生存，廣泛存在于油藏、硫黃礦等氧氣缺乏的自然環(huán)境中［2］。硫酸鹽作為SRB生長(zhǎng)代謝過程中的電子受體，會(huì)在細(xì)菌胞內(nèi)被還原為亞硫酸鹽，并進(jìn)一步還原為硫化氫、硫化亞鐵等對(duì)生產(chǎn)有害的物質(zhì)。管道中的硫化氫會(huì)引起管道的腐蝕產(chǎn)生惡臭，可能導(dǎo)致維修人員中毒等安全事故［3］，產(chǎn)生的硫化亞鐵會(huì)污染原油，降低原油品質(zhì)。在海上油田早期開發(fā)生產(chǎn)中，海水常被用于注入油井進(jìn)行水驅(qū)開發(fā)，因此大量富含硫酸鹽的海水進(jìn)入油藏，油藏內(nèi)的SRB即可利用硫酸鹽大量擴(kuò)增，加劇硫化氫的產(chǎn)生和腐蝕問題的出現(xiàn)。

目前，治理SRB 的方法主要包括物理法、化學(xué)法和生物法。物理方法包括紫外照射、膜法除鹽、機(jī)械除渣等，這些方法治理效果較好，但在現(xiàn)場(chǎng)條件下實(shí)施較為困難。化學(xué)法包括使用氯酸鈉等氧化型殺菌劑和季銨鹽類等非氧化型殺菌劑。此類方法治理效果明顯，但容易造成污染、細(xì)菌的耐藥性、且成本較高。生物法主要是利用硝酸鹽還原菌（nitrate-reducing bacteria，NRB）競(jìng)爭(zhēng)性抑制SRB 生長(zhǎng)的方法［4-10］，也稱為生物競(jìng)爭(zhēng)排斥技術(shù)（biocompetitive exclusion，BCX）。該方法具體原理是向油藏內(nèi)注入低濃度的硝酸鹽/亞硝酸鹽，相比于硫酸鹽，硝酸鹽/亞硝酸鹽更易成為電子受體，從而促進(jìn)油藏內(nèi)存在的NRB大量生長(zhǎng)擴(kuò)增，并與SRB競(jìng)爭(zhēng)生存空間及底物，阻止SRB 獲得所需的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，控制SRB的代謝活性。

目前生物競(jìng)爭(zhēng)排斥技術(shù)已經(jīng)在油藏SRB 治理中得到大量應(yīng)用，但現(xiàn)場(chǎng)注入工藝一直是影響該技術(shù)使用效果的主要限制因素。筆者在室內(nèi)研究的基礎(chǔ)上，以不同注入方式向模擬地層環(huán)境中注入硝酸鹽，激活NRB 抑制SRB，探索抑制SRB 活性的最佳硝酸鹽注入方式。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

地層水取自綏中油田某生產(chǎn)井，離子組成（單位 mg/L）為使用前在12000 r/min、4℃條件下離心20 min，然后在121℃下高壓蒸汽滅菌20 min。菌種取自綏中油田某生產(chǎn)井水樣，使用SRB 培養(yǎng)基（g/L）（0.5 KH2PO4、1.0 NH4Cl、1.0 Na2SO4、0.05 CaCl2、2.0 MgCl2·6H2O、1.0 酵母提取物（yeast extract）、0.1 抗壞血酸（VC）、0.1 CH3COONa、1.1 d-C3H6O3Na）、NRB培養(yǎng)基（g/L）（0.5 KH2PO4、1.0 NH4Cl、1.0 NaNO3、0.05 CaCl2、2.0 MgCl2·6H2O、1.0 yeast extract、0.1 VC、1.0 CH3COONa）在58℃下培養(yǎng)以富集水樣中的SRB 和NRB。培養(yǎng)基中的試劑購(gòu)自天津希恩思生化科技有限公司、天津科密歐化學(xué)試劑有限公司、天津津東天正精細(xì)化工試劑廠等化學(xué)試劑公司。SYBR Green qPCR Master Mix（綠色熒光染料混合試劑），日本TaKaRa公司；硫酸鹽快速檢測(cè)試劑盒，英國(guó)Modernwater 公司；硫酸鹽還原菌水質(zhì)測(cè)試瓶SRB-HX，北京華興化學(xué)試劑廠；Axygen 細(xì)菌基因組小提試劑盒（Lysis buffer、溶菌酶），美國(guó)Axygen公司；NaNO3、十二烷基硫酸鈉（SDS），分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

iQTM5 熒光定量 PCR 儀，美國(guó) Bio-Rad 公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma 公司；SpectroDirect分光光度計(jì)，德國(guó)羅威邦公司；硫化氫檢測(cè)管，德國(guó)德爾格公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）現(xiàn)場(chǎng)采樣

取25 L 干凈塑料桶用醫(yī)用酒精洗2數(shù)3 遍，備用；根據(jù)井口壓力選擇性接上高（低）壓取樣器，打開取樣閥，讓采出液流出5數(shù)10 min 并沖洗塑料桶2數(shù)3 遍；將采出液灌滿塑料桶（不留空氣體積），每口井25 L（其中原油至少1 L，地層水至少10 L），擰緊蓋子密閉常溫保存（注意冬季防凍結(jié)、夏季防暴曬）；樣品采集后盡快運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品預(yù)處理。

（2）模擬實(shí)驗(yàn)

用地層水將SRB 培養(yǎng)基稀釋10 倍，用SRB 測(cè)試瓶培養(yǎng)SRB和NRB。以地層水為培養(yǎng)基，滅菌后以1%的接種量接入SRB和NRB，使SRB和NRB的接入量與油藏中的比例相同。設(shè)置每日0、20、40、80 mg/L 和每 5 d 100、200、400 mg/L 的硝酸鹽注入梯度，根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)實(shí)際注入濃度，研究不同硝酸鹽注入濃度、注入方式（每天注入、一次性注入）下，硫化氫濃度、SRB 和 NRB 數(shù)量的變化，得到現(xiàn)場(chǎng)的最佳注入方式。

（3）樣品DNA的提取和保存

取菌液20 mL 于離心管中，12000 r/min 離心10 min；菌體使用1 mL Lysis buffer 洗兩次后，用0.6 mL Lysis buffer重懸并加入0.2 g玻璃珠研磨1 min，重復(fù)3次，使用終濃度為10 mg/mL的溶菌酶在37℃下反應(yīng)1 h，加入120 μL 20%的SDS 在65℃下反應(yīng)1 h，之后按照Axygen細(xì)菌基因組小提試劑盒第5步開始完成后續(xù)提取，具體方法步驟參照說明書。

（4）SRB和NRB數(shù)量測(cè)定

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行定量，使用SRB共有基因上游引物dsrF：CAACATCGTYCAYACCCAGGG和SRB共有基因下游引物dsrR：GTGTAGCAGTTACCGCA 對(duì) SRB 進(jìn)行絕對(duì)定量；使用NRB 共有基因上游引物napAF：CTGGACIATGGGYTTIAACCA 和NRB 共有基因下游引物napAR：CCTTCYTTYTCIACCCACAT 對(duì) NRB 進(jìn)行絕對(duì)定量。

（5）培養(yǎng)液中各離子和硫化氫濃度的測(cè)定

在 500 mL 油水體系中加入 200、400 mg/L 的抑制藥劑（NaNO3），混合均勻后置于58℃恒溫培養(yǎng)箱中，定時(shí)取樣檢測(cè)和中間產(chǎn)物的濃度，分析模擬油藏條件下，油藏中的SRB、NRB菌群對(duì)抑制藥劑的代謝速率和特性，為現(xiàn)場(chǎng)注入工藝調(diào)整提供技術(shù)支持。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子濃度的變化

圖1 硝酸鹽注入方式對(duì)硫酸根濃度的影響

圖2 硝酸鹽注入方式對(duì)硝酸根濃度的影響

圖3 硝酸鹽注入方式對(duì)亞硝酸根濃度的影響

2.2 H2S濃度的變化

H2S是SRB作用后的代謝產(chǎn)物，分析H2S濃度可了解SRB抑制效果。由圖4可知，對(duì)比空白組，加入藥劑組（第2數(shù)7組數(shù)據(jù)點(diǎn)完全重合）自始至終沒有硫化氫的產(chǎn)生，說明無論每日加藥方式和一次性加藥方式對(duì)抑制SRB產(chǎn)生S2-均有顯著的效果。

圖4 硝酸鹽注入方式對(duì)硫化氫濃度的影響

2.3 SRB、NRB菌數(shù)的變化

硝酸鹽注入方式對(duì)SRB、NRB菌數(shù)的影響見圖5?？瞻捉MSRB 菌數(shù)在前4 d 持續(xù)增長(zhǎng)，在第4 d SRB 菌數(shù)達(dá)到2.89×104個(gè)/mL，這正好與圖1中第4大量消耗相對(duì)應(yīng)，說明SRB 利用大量增殖，同時(shí)也造成濃度下降，此后SRB 開始減少，但由于SRB 濃度尚維持在一定水平的消耗速率并未明顯降低，說明體系內(nèi)的濃度降低后，SRB 因無可用而產(chǎn)生數(shù)量上的降低。加藥組中，SRB、NRB 濃度均有一定升高，說明加入的激活了體系內(nèi)的NRB，同時(shí)SRB也能優(yōu)先利用高濃度的而增殖，因此即使在加入藥劑條件下，因的濃度變化，SRB數(shù)量也會(huì)呈現(xiàn)某種程度波動(dòng)，但因?yàn)橹虚g產(chǎn)物的存在及有機(jī)碳源等底物的消耗，SRB 濃度總體趨勢(shì)是下降的，且S2-產(chǎn)出明顯降低。對(duì)比圖5（a）、（b）可見，在加入藥劑的第1 d，SRB菌數(shù)降低，但隨后NRB菌數(shù)迅速回升并快速生長(zhǎng)，一直到第3 d 生長(zhǎng)至頂峰，隨后會(huì)因?yàn)榧坝袡C(jī)碳源的消耗，造成營(yíng)養(yǎng)不足開始衰退。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一次性注入藥劑在初期對(duì)于NRB 的增殖效果要明顯優(yōu)于每日注入等量藥劑的效果，說明在治理初期，體系內(nèi)有機(jī)碳源含量高時(shí)，低濃度的無法直接抑制SRB，只有在NRB 存在的情況下，NRB 利用產(chǎn)生才能起到抑制作用，而高濃度大劑量的可以有效地抑制SRB。高濃度可誘導(dǎo)SRB 優(yōu)先還原并產(chǎn)生中間產(chǎn)物從兩個(gè)方面抑制SRB，但此時(shí)NRB 的存在也會(huì)消耗體系內(nèi)的引發(fā)SRB還原的過程。在治理中后期會(huì)繼續(xù)促使 SRB 利用有機(jī)碳源還原從而使其沒有足夠的碳源來還原同時(shí)NRB 的存在也會(huì)進(jìn)一步消耗有機(jī)碳源，抑制SRB濃度作用更加明顯；另外，在SRB受到抑制后，持續(xù)加入的效果要優(yōu)于一次性加入，具體表現(xiàn)為在停藥后一次性注入的SRB 反彈速度要高于持續(xù)加入，說明大劑量加藥在中后期的培養(yǎng)體系中及有機(jī)碳源由于在治理前期消耗過快，體系內(nèi)剩余濃度不足，不能進(jìn)一步抑制SRB 的生長(zhǎng)，從而造成SRB反彈更快，而持續(xù)加藥的體系，盡管前期抑制效果不佳，但中后期體系內(nèi)能保持一定的藥劑濃度，可持續(xù)對(duì)SRB產(chǎn)生抑制效果。

2.4 SRB、NRB對(duì)N的利用

圖5 硝酸鹽注入方式對(duì)細(xì)菌數(shù)量的影響

圖6 模擬地層條件下微生物對(duì)不同濃度的利用性

3 結(jié)論