劉潺潺 李 婷

(中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院(光明)，深圳 518000)

重癥肌無力(MG)是一種神經(jīng)肌肉接頭的自身免疫性疾病，早在1973年在MG患者身上發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿受體抗體(AchR-Ab)，2001年在MG患者中才又發(fā)現(xiàn)了一種新的抗體，肌肉特異性受體酪氨酸激酶抗體(MuSK-Ab)。乙酰膽堿受體(AchR)和MuSK抗體陽性的MG是具有獨(dú)立免疫學(xué)靶點(diǎn)的自身免疫性疾病。與神經(jīng)肌肉接頭功能障礙的機(jī)制不同，兩者臨床表現(xiàn)與治療差別很大[1]，比如MuSK MG經(jīng)常呈現(xiàn)近端肩胛肌和面部肌無力的特征性臨床表現(xiàn)，更多的肌無力危象和呼吸衰竭，長期預(yù)后較差。在突觸形成過程中，MuSK能調(diào)節(jié)AchR聚集，所以MuSK能維持AchR的正?？臻g結(jié)構(gòu)，從而保障突觸功能。國外報(bào)道AchR抗體陰性的患者，MuSK抗體陽性占 38%～47%左右，相當(dāng)于所有MG患者中的10%左右。MuSK-MG患者胸腺增生少見，胸腺瘤罕見，而且胸腺切除術(shù)后MuSK抗體血清保持不變，所以胸腺切除對MuSK患者療效較差，構(gòu)建MuSK-Ab小鼠模型有利于該疾病的研究[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物：6～8周的雌性C57BL/6小鼠,購于華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)單位為三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號SCXK(鄂)2017-0012。

1.1.2試劑：MuSK-弗氏佐劑(Difco，Detroit，MI，USA),鼠源肽，CFA完全費(fèi)氏佐劑。

1.2 方法

1.2.1MuSK小鼠模型的制備

雌性C57BL/6小鼠40只，分成實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組各20只小鼠。通過胰島素注射器從尾靜脈給藥2次對小鼠進(jìn)行免疫。第1次實(shí)驗(yàn)組20只小鼠麻醉并用30μg的MuSK-弗氏佐劑免疫，對照組20只小鼠僅用CFA免疫。28 d后進(jìn)行第2次免疫：實(shí)驗(yàn)組給予MuSK-弗氏佐劑，對照組給予等量PBS。適應(yīng)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行造模。造模第1天在 4個(gè)位置(兩只后腳和肩部)分別注射免疫抗原(每個(gè)部位50 μL，含12.5ug鼠源肽，CFA完全費(fèi)氏佐劑)；造模第30及50天再次在上述4個(gè)位置(兩只后腳和肩部)分別注射免疫抗原(每個(gè)部位50 μL，含12.5ug 鼠源肽，CFA不完全費(fèi)氏佐劑)[2]。參照文獻(xiàn)要求[1]，實(shí)驗(yàn)組第2次免疫后每周測抓力，做翻籠試驗(yàn)，每天測臨床評分和體質(zhì)量，第70天后每天對發(fā)病情況進(jìn)行評分。

1.2.2臨床檢查：臨床檢查是先將小鼠在平臺上放置3 min，觀察小鼠的精神狀態(tài)，有無虛弱，脫水，小鼠的活動情況，四肢肌力，有無癱瘓等，以便與鍛煉后情況進(jìn)行對照。對小鼠按下面的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。

(1)按國際重癥肌無力小鼠臨床評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分(Clinical scores)[2]:首先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)鍛煉，放置金屬網(wǎng)格，輕抓小鼠的尾巴，小鼠抓住金屬網(wǎng)格時(shí)，再將老鼠提起，如此重復(fù)20次，然后讓小鼠自由行走并進(jìn)行測分：

1)0分，鍛煉前活動正常，沒有虛弱或疲勞的跡象。在標(biāo)準(zhǔn)鍛煉后，老鼠似乎比正常情況下不太活躍，或顯示出其他輕微疲勞虛弱的跡象，

2)1分，鍛煉前活動正常，但在標(biāo)準(zhǔn)的鍛煉方案后，它會俯臥不動，下巴著地，不能抬頭，縮成一團(tuán)，活動性減少，頭部和尾巴擱在工作臺上(懸掛時(shí)間小于60 s)。當(dāng)小鼠達(dá)到這個(gè)等級時(shí)，應(yīng)將柔軟、潮濕的食物放在籠子的地板上。

3)2分，鍛煉前小鼠即出現(xiàn)活動性減少，常俯臥不動，頭部及尾巴擱在工作臺上，縮成一團(tuán)，但未出現(xiàn)脫水，癱瘓，很大程度上保持著腦袋不動和尾巴休息(懸掛時(shí)間小于30 s)。

4)3分，小鼠即非常虛弱，脫水，癱瘓，體質(zhì)量明顯下降。評分為3分的小鼠出現(xiàn)脫水和癱瘓，體質(zhì)量下降達(dá)15%(懸掛時(shí)間=0)。

5)4分，小鼠死亡。

(2)抓力試驗(yàn)和翻籠試驗(yàn)

1)抓力試驗(yàn)(Grip strength)

輕抓小鼠的尾巴，當(dāng)小鼠懸起時(shí)，下面放金屬網(wǎng)格，老鼠抓住金屬網(wǎng)格時(shí)，將老鼠提起，重復(fù)20次后測拉力。

一端固定在拉力器上，測力器做成前端網(wǎng)格形。抓住小鼠尾巴，讓小鼠抓住測力器的前端，用力拉小鼠的尾巴，當(dāng)小鼠力量不夠抓住測力器前端時(shí)，此時(shí)測力器顯示為抓力。

2)翻籠試驗(yàn)(Inverted screen test)

翻籠試驗(yàn)是用來定量評估四肢肌力的測試方法。小鼠被放在了網(wǎng)格的中心后立即旋轉(zhuǎn)到倒立位置，穩(wěn)定地保持在軟墊上方50 cm。記錄小鼠掉下的時(shí)間,觀察時(shí)間限定在300 s。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,MuSK-MG小鼠建模成功率采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。

2 結(jié)果

評分結(jié)果見表1，評分為≥1提示造模成功，建模成功率50%；3分和4分的小鼠抓力試驗(yàn)和翻籠試驗(yàn)明確減退，有利于下一步藥物試驗(yàn)。評分為1至4分為造模成功，成功率為50%，P=0.00026，見表1。

表1 評分結(jié)果Table 1 Mouse clinical score results

3 討論

AchR自身抗體主要在免疫球蛋白G(IgG)IgG1和IgG3亞型中，直接阻斷受體功能。相比之下，MuSK抗體主要是IgG4，不激活補(bǔ)體，而是抑制MuSK在終板誘導(dǎo)AchR的正常聚集[3]。肌肉活檢和上肢肌肉的電生理研究沒有顯示任何AchR減少或補(bǔ)體沉積在MuSK陽性的MG中。MuSK-Abs的致病性已經(jīng)通過患者純化IgG被動轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)動物上得到證實(shí)[4]。與正常對照相比，MuSK-Ab 陽性的MG患者輔助性T細(xì)胞(Th)Th 1和Th17水平更高，而B10細(xì)胞百分比更低。由于B細(xì)胞10是免疫耐受和免疫激活調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)，這些結(jié)果與Th1 /Th17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和自身抗體產(chǎn)生是一致的，是 MuSK-MG的主要機(jī)制[5]。

MuSK-MG的小鼠模型中最近研究結(jié)果表明，吡斯的明加劇了終板AchR損失，而3,4-二氨基吡啶增強(qiáng)了神經(jīng)肌肉傳遞[6]。

C57BL/6、AJ 和 bm12小鼠容易造模，但是BALB/c不適合用來做MuSK小鼠模型。A/WySnJ,A/J,DBA/2,FVB/N小鼠更適合作為造模小鼠，具體原因不明[7]。必須定期監(jiān)測動物，并防止不必要的痛苦。在開始治療前幾天開始的被動免疫注射過程中，每天都要進(jìn)行體質(zhì)量和疲勞虛弱的測量，以使動物熟悉操作人員。主動免疫研究的時(shí)間較長(4至11周)。對于這類研究，在第2次免疫接種之前，可以接受較不頻繁的例行檢查，到第2次免疫接種時(shí)應(yīng)開始每日檢查。由于老鼠有一個(gè)晝夜節(jié)律的活動周期，一個(gè)有規(guī)律的12小時(shí)的光/暗周期應(yīng)該在每天的同一時(shí)間進(jìn)行，最好是上午10點(diǎn)到下午1點(diǎn)[8-9]。

本研究按照國外文獻(xiàn)制備MuSK-MG的小鼠模型，統(tǒng)一測評方法，與現(xiàn)有研究結(jié)果一致，造模方法可行。有利于重癥肌無力疾病的進(jìn)一步研究。