杜 凱 李文光 吳德國 趙德明

(1.中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所,北京 100101)(2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué),北京 100094)

實(shí)驗動物是相關(guān)科學(xué)研究重要的、不可或缺的實(shí)驗材料，動物的質(zhì)量可直接反映出科研水平的高低[1]。小鼠巨細(xì)胞病毒可導(dǎo)致小鼠肺炎，感覺神經(jīng)性耳聾，眼內(nèi)感染，心臟感染(心包心肌炎、營養(yǎng)不良性心臟鈣化，皮膚感染皰疹)，腦炎，肝炎等[2-4]，對毒理學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)等試驗會產(chǎn)生影響。因此，從事相關(guān)試驗研究使用的小鼠需要排除小鼠巨細(xì)胞病毒的感染。

1 材料與方法

1.1 小鼠來源

結(jié)扎鼠、供體鼠、受體鼠來源于遺傳發(fā)育所動物中心。待凈化鼠：C57小鼠,經(jīng)檢測種群感染小鼠巨細(xì)胞病毒。

1.2 實(shí)驗藥品

PMSG、hCG分別購自寧波第二激素廠和SIGMA公司，M2操作液、M16培養(yǎng)液和二甲基亞砜(DMSO)購自SIGMA公司。

1.3 方法

1.3.1結(jié)扎雄鼠的準(zhǔn)備：雙側(cè)輸精管結(jié)扎雄鼠。手術(shù)1周后，與雌鼠交配，見到陰道栓的雌鼠未懷孕，證明雄鼠結(jié)扎成功，可使用。使用時，做好見栓記錄，連續(xù)4～6次不見栓的結(jié)扎鼠以二氧化碳吸入法[5]淘汰處死。

1.3.2供體鼠的超排處理：雌鼠在實(shí)驗第1天下午16時腹腔注射PMSG，第3天下午16時腹腔注射hCG。注射hCG后，1只雌鼠與1只雄鼠進(jìn)行合籠。第4天上午8時檢查雌鼠陰道是否有栓塞，見栓的鼠作為供體。

1.3.3受體的同期發(fā)情處理：假孕雌鼠是通過用結(jié)扎雄鼠與受體鼠交配得到的。第3天下午16時，結(jié)扎雄鼠與受體鼠合籠交配。

1.3.4胚胎采集、沖洗：在實(shí)驗的第5天，通過脫頸法處死供體雌鼠，用70%的酒精噴灑腹部，使用眼科剪在腹部中間剪開一個小口。眼科鑷夾住剪開的皮膚，向頭尾部拉伸使毛發(fā)脫離腹腔.。眼科剪剪開腹膜，取出輸卵管、子宮，轉(zhuǎn)移到裝有M2的平皿上。注射器吸取沖胚液，將胚胎沖出。使用移卵管將胚胎收集起來，轉(zhuǎn)移到含新鮮M2的培養(yǎng)液中，反復(fù)洗幾次。將胚胎轉(zhuǎn)移至微滴培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液清洗，37 ℃、5%二氧化碳的條件培養(yǎng)暫存。

1.3.5品質(zhì)鑒定：在胚胎保存液中將胚胎清洗2～3次后，放于顯微鏡下觀察，品質(zhì)鑒定分為優(yōu)良胚胎、普通胚胎、不良胚胎和不可用胚胎，其中優(yōu)良胚胎和普通胚胎為可用胚胎。

1.3.6胚胎移植：交配后0.5～3.5 d的單細(xì)胞發(fā)育到囊胚階段的胚胎，可以移植到假孕雌鼠的生殖道內(nèi)使其繼續(xù)發(fā)育。1.5 d的胚胎可以移植到假孕1.5 d小鼠的輸卵管壺腹部，而3.5 d的胚胎可以移植到2.5 d或3.5 d假孕雌鼠的子宮內(nèi)。

1.3.7檢測:受體鼠產(chǎn)仔后，利用已報道的小鼠巨細(xì)胞病毒PCR檢測方法[6]進(jìn)行檢測。

1.4 試驗

1.4.1不同廠商激素的對比試驗:按照1.3.2介紹的超排方法進(jìn)行，使用不同廠商、不同劑量的激素進(jìn)行超排處理，對比得到的胚胎數(shù)量，以及優(yōu)良胚胎和正常胚胎占到總胚胎數(shù)量的比率。選取的兩家PMSG、HCG廠家為：SIGMA、寧波第二激素廠。劑量分別選取5、7.5、10IU。

1.4.2小鼠不同發(fā)情周期注射激素的對比試驗:選取不同發(fā)情周期的供體小鼠注射PMSG，后續(xù)超排按照1.3.2方法進(jìn)行，對比超排出受精卵的數(shù)量，用以確定選取哪個發(fā)情周期的小鼠進(jìn)行超排處理。

1.4.3受體鼠品系的對比試驗:選取C57、ICR、C57雄性與ICR雌性交配的子一代(CIF1代)以及C57雌性與ICR雄性交配的子一代(ICF1代)作為受體鼠，利用輸卵管移植法移植C57小鼠2細(xì)胞的胚胎，雙側(cè)輸卵管移植，移植相同數(shù)量的胚胎，對比仔鼠出生后的移植率。

1.4.4輸卵管移植與子宮移植產(chǎn)仔率的對比試驗:選取C57小鼠，隨機(jī)分成兩組。分別進(jìn)行輸卵管移植和子宮移植，均進(jìn)行雙側(cè)移植。產(chǎn)仔后計算產(chǎn)仔數(shù)量，得出產(chǎn)仔率。

1.4.5不同時期胚胎通過輸卵管移植的成功率試驗:采集的C57小鼠的單細(xì)胞、2細(xì)胞和8細(xì)胞胚胎，進(jìn)行輸卵管移植，移植到ICR母鼠的輸卵管內(nèi)，觀察受體鼠的妊娠率，用以評價不同時期的胚胎對輸卵管移植成功率的影響。

1.4.6輸卵管移植移植胚胎數(shù)量的對比試驗:選取品質(zhì)在優(yōu)良、正常的2細(xì)胞胚胎，移植到受體鼠的輸卵管內(nèi)，每只小鼠移植12、24、32枚胚胎，觀察受體鼠的產(chǎn)仔率，用以評價移植胚胎數(shù)目的不同對輸卵管移植效果的影響。

2 結(jié)果

2.1 不同廠商激素的對比試驗結(jié)果

按照1.3.2介紹的方法分別對8周C57小鼠60只使用不同廠商、不同劑量的激素進(jìn)行超排處理，對比得到的胚胎數(shù)量，以及優(yōu)良胚胎和正常胚胎占到總胚胎數(shù)量的比率。由表1可知，使用SIGMA生產(chǎn)的激素超排效果無論從可用胚胎數(shù)和可用胚胎比率看，均明顯優(yōu)于寧波第二激素廠。SIGMA產(chǎn)激素超排不同劑量間可用胚胎比率差別不大，使用10IU劑量超排C57小鼠的優(yōu)良、正常胚胎數(shù)約17枚/只。

表1 不同廠商不同劑量的激素對比試驗結(jié)果Table 1 Results of different hormones in different manufacturers

2.2 小鼠不同發(fā)情周期注射激素的對比試驗結(jié)果

每組分別選取10只發(fā)情間期、發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期8周的C57小鼠，按照1.3.2介紹的方法進(jìn)行超排處理，SIGMA產(chǎn)激素使用10IU，對比得到的胚胎數(shù)量，以及優(yōu)良胚胎和正常胚胎占總胚胎數(shù)量的比率。由表2可知，在小鼠的發(fā)情間期超排，得到的優(yōu)良、正常胚胎數(shù)量最多，平均每只小鼠獲得約23枚胚胎。

表2 不同發(fā)情周期注射激素的對比結(jié)果Table 2 Results of injection hormones in different estrous cycles

2.3 受體鼠品系的對比試驗結(jié)果

選取8周的C57、ICR、CIF1代和ICF1代的受體鼠，采用輸卵管移植方法，雙側(cè)輸卵管移植，移植25枚2細(xì)胞胚胎，待仔鼠出生后計算產(chǎn)仔數(shù)量，得出4種不同品系的小鼠的產(chǎn)仔率分別為37.5%、42%、44.5%和43.5%。由表3可知，CIF1代小鼠作為受體產(chǎn)仔率較高。

表3 受體鼠品系的對比結(jié)果Table 3 Results of recipient mouse strains

2.4 輸卵管移植與子宮移植產(chǎn)仔率對比試驗結(jié)果

選取17只ICR小鼠，隨機(jī)分成兩組，分別進(jìn)行輸卵管移植和子宮移植，均進(jìn)行雙側(cè)移植，其中輸卵管移植ICR母鼠10只共移植251枚優(yōu)良、正常胚胎，子宮移植受體母鼠7只共移植211枚C57小鼠胚胎。由表4可知，輸卵管移植和子宮移植分別產(chǎn)仔102只、58只，產(chǎn)仔率分別為40.64%、27.49%。

表4 不同移植方法產(chǎn)仔率對比試驗結(jié)果Table 4 Results of different transplantation methods in birth rate

2.5 不同時期胚胎通過輸卵管移植的成功率試驗結(jié)果

采集C57小鼠的單細(xì)胞、2細(xì)胞和8細(xì)胞胚胎，進(jìn)行輸卵管移植，移植到ICR母鼠的輸卵管內(nèi)，觀察受體鼠的妊娠率，由表5可知，移植2細(xì)胞胚胎的妊娠率最高，達(dá)到了80%，而移植單細(xì)胞和8細(xì)胞的妊娠率分別為50%和40%。

表5 移植不同時期胚胎的對比試驗結(jié)果Table 5 Results of embryo transfer in different periods

2.6 輸卵管移植移植胚胎數(shù)量的對比試驗結(jié)果

選取品質(zhì)在優(yōu)良、正常的2細(xì)胞胚胎，移植到受體鼠的輸卵管內(nèi)，每只小鼠移植12、24、32枚胚胎，以觀察受體鼠的產(chǎn)仔率。由表6可知：當(dāng)受體鼠移植24枚胚胎時，產(chǎn)仔率最高達(dá)到了43.75%，而移植12、32枚胚胎的產(chǎn)仔率分別為37.5%和34.38%。

表6 移植數(shù)量的對比試驗結(jié)果Table 6 Results of different numbers of embryo transfer

2.7 仔鼠的檢測結(jié)果

仔鼠出生后，眼角靜脈叢采集抗凝血。利用小鼠巨細(xì)胞病毒PCR檢測方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示均為陰性，見圖1。說明感染小鼠巨細(xì)胞病毒的SPF級小鼠，經(jīng)過建立優(yōu)化的胚胎移植凈化方法，成功排除了小鼠巨細(xì)胞病毒的感染。

圖1 PCR檢測結(jié)果注：M:D2000 Marker;1:陽性對照;2:陰性對照;3:樣品1;4:樣品2;5:樣品3;6:樣品4;7:樣品5Fig.1 Results of PCRNote：M:D2000 Marker;1:Positive control;2:Negative control;3:Sample1;4:Sample2;5:Sample3;6:Sample4;7:Sample5

3 討論

用于小鼠凈化的方法主要為藥物凈化、剖腹產(chǎn)凈化和胚胎移植凈化[7-9]。藥物凈化有一定的作用[10]，凈化不理想，難以達(dá)到目的。剖腹產(chǎn)凈化主要難點(diǎn)在于較難判斷母鼠的妊娠期，而且仔鼠的氣味會影響其代乳過程中的存活和育成，有的病毒(如淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒)可通過胎盤造成凈化的失敗。胚胎移植技術(shù)逐漸受到試驗人員的重視。小鼠的胚胎透明帶可形成一道天然的屏障，能有效地抵御細(xì)菌、病毒的侵入[11]，能通過胎盤屏障的病原體也不能穿透透明帶，且胚胎在供體鼠體內(nèi)時間很短，也有效降低了母子間垂直傳播的可能性，同時在胚胎移植過程中的沖洗步驟還能有效減弱或消除病原體的活力[12]，這些極大地增加了對病原體凈化的有效性，為排除小鼠巨細(xì)胞病毒奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)[13]。

本文利用優(yōu)化的胚胎移植凈化技術(shù)對感染了小鼠巨細(xì)胞病毒的SPF級小鼠進(jìn)行了胚胎移植凈化，獲得了無小鼠巨細(xì)胞病毒感染的SPF級小鼠。