康愛君 劉君芳 李雨薇 胡建國 王學(xué)文 鄭振輝

(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部，北京 100191)

血常規(guī)是動物實驗過程中衡量動物生理狀態(tài)、判定及評價疾病動物模型的重要指標(biāo)之一[1-2]。應(yīng)用全自動血細胞分析儀測定血常規(guī)時有兩種測定方法可供選擇：靜脈血測定法和微量血測定法。靜脈血測定法需要的血量較大，且需要配制抗凝劑或準(zhǔn)備抗凝管；微量血測定法需要的血量少，只需將20 μL或10 μL全血加到定量的血細胞分析用稀釋液中制成血細胞懸液上機測定即可。小鼠體型小、血量少，且動物實驗過程中大多需要多次采集血液樣本，考慮到動物的健康和繼續(xù)生存的要求，每次的采血量受到限制，這就無法應(yīng)用靜脈血測定法進行檢測，只能選擇微量血測定法。血常規(guī)測定的影響因素多且復(fù)雜，其中血液樣本放置時間是比較重要的影響因素[3-6]。關(guān)于靜脈血(全血)放置時間對血常規(guī)指標(biāo)的影響，在臨床診斷以及動物試驗中已有相關(guān)報道[7-9].應(yīng)用微量血測定時，將微量靜脈血加入分析用稀釋液制成靜脈血細胞懸液的放置時間對小鼠血常規(guī)測定的影響還未見報道.檢測過程中，我們發(fā)現(xiàn)由于動物實驗樣本量大或動物實驗室與檢測室距離較遠時會造成送檢血樣不及時、放置時間過長現(xiàn)象，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，本文選擇了動物實驗中常用的兩個小鼠品種(系)ICR小鼠和C57BL/6 J小鼠，旨在觀察稀釋后的靜脈血細胞懸液分別放置15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h血常規(guī)各項指標(biāo)的變化，為科研人員在動物實驗中血常規(guī)測定方面提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物為SPF級ICR小鼠和C57BL/6 J小鼠各20只，共40只，雄性，8周齡，20～22 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0010。飼養(yǎng)環(huán)境為屏障環(huán)境，使用許可證號：SYXK(京)2016-0041，溫度為(24±2)℃，相對濕度為(50±10)%，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 儀器和試劑

MEK-6410C全自動血細胞分析儀，日本光電工業(yè)株式會社生產(chǎn)。血細胞分析用稀釋液和清洗液由上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 血常規(guī)測定

血常規(guī)測定前做好室內(nèi)質(zhì)控、空白計數(shù)，確保儀器符合檢測標(biāo)準(zhǔn)。采集靜脈血液80 μL加到定量血細胞分析用稀釋液中混勻，制成靜脈血細胞懸液，密封備用，于0 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h在MEK-6410C全自動血細胞分析儀上應(yīng)用微量血測定法測定血常規(guī)。包括白細胞總數(shù)(white blood cell count，WBC)、紅細胞總數(shù)red blood cell count，RBC)、血小板(platelet，PLT)、血紅蛋白濃度(hemoglobin，HGB)、紅細胞壓積(hematocrit，HCT)、紅細胞平均體積(mean corpuscular volume，MCV)、平均血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin,MCH)、平均血紅蛋白濃度(mean corpuscular hemoglobin concentration,MCHC)、紅細胞分布幅度(red blood cell distribution width,RDW)、血小板分布幅度(platelet distribution width,PDW)、平均血小板體積(mean platelet volume,MPV)和血小板壓積(thrombocytocrit,PCT)。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 ICR小鼠靜脈血細胞懸液放置不同時間血常規(guī)各項指標(biāo)的變化

與0 min相比，RBC在2 h、4 h、6 h和8 h均顯著降低(P<0.01)，PLT在4 h、6 h和8 h均顯著升高(P<0.01)，PCT在2 h、4 h、6 h和8 h均顯著升高(P<0.01)，MPV在2 h、4 h、6 h和8 h均顯著升高(P<0.01)，MCV在4 h顯著降低(P<0.05)、在6 h和8 h也均顯著降低(P<0.01)，MCHC在30 min、1 h、2 h、4 h、6 h和8 h均顯著升高(P<0.01)，MCH在1 h、2 h、4 h、6 h和8 h均顯著升高(P<0.01)，HCT在1 h、2 h、4 h、6 h和8 h均顯著降低(P<0.01)，WBC、RDW、PDW和HGB無顯著變化(P>0.05),詳見表1。

表1 ICR小鼠靜脈血細胞懸液放置不同時間血常規(guī)各項指標(biāo)的變化Table 1 Changes of blood routine indexes in venous haematocyte suspension of ICR mice at different

注：與0 min比較，*P<0.05,**P<0.01
Note:Compare with 0 min,*P<0.05,**P<0.01

2.2 C57BL/6 J小鼠靜脈血細胞懸液放置不同時間血常規(guī)各項指標(biāo)的變化

與0 min相比，RBC在2 h顯著降低(P<0.05)、在4 h、6 h和8 h也均顯著降低(P<0.01)，PLT在4 h、6 h和8 h均顯著升高(P<0.01)，PCT在4 h、6 h和8 h均顯著升高(P<0.01)，MPV在2 h顯著升高(P<0.05)、在4 h、6 h和8 h也均顯著升高(P<0.01)，MCV在1 h、2 h、4 h、6 h和8 h均顯著降低(P<0.01)，MCHC在30 min、1 h、2 h、4 h、6 h和8 h均顯著升高(P<0.01)，MCH在2 h、4 h、6 h和8 h均顯著升高(P<0.01)，HCT在1 h、2 h、4 h、6 h和8 h均顯著降低(P<0.01)，WBC、RDW、PDW和HGB無顯著變化(P>0.05),詳見表2。

表2 C57BL/6 J小鼠靜脈血細胞懸液放置不同時間血常規(guī)各項指標(biāo)的變化Table 2 Changes of blood routine indexes in venous haematocyte suspension of C57BL/6 J mice at different

注：與0 min比較，*P<0.05,**P<0.01
Note:Compare with 0 min,*P<0.05,**P<0.01

3 討論

研究結(jié)果表明，應(yīng)用微量血測定法檢測血常規(guī)時檢測數(shù)據(jù)會因靜脈血細胞懸液放置時間不同而發(fā)生改變。變化的原因是血細胞懸液在放置過程中血細胞的代謝反應(yīng)、水分的蒸發(fā)作用、化學(xué)反應(yīng)等多方面的作用[10]。血樣采集人員應(yīng)安排專業(yè)人員盡快將制備好的血細胞懸液送達檢驗室，盡量縮短運送時間，檢驗人員收到血細胞懸液后也應(yīng)及時檢測，減少因放置時間過長對血樣帶來的不利影響，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確。

本研究采用微量血測定法測定小鼠血常規(guī)。臨床上大都通過皮膚采集末梢血，皮膚采集血液時，雖然能采到血液標(biāo)本，但經(jīng)皮膚采集的末梢血容易溶血、凝血，還容易混入組織液，影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性[11]。另外，有研究證明，血常規(guī)檢測中靜脈血比末梢血檢測結(jié)果更準(zhǔn)確可靠，且靜脈血采集較少受人為因素影響[11-15]，所以本研究采血部位選擇靜脈，取微量靜脈血加入血細胞分析用稀釋液中制成靜脈血細胞懸液密封后放置不同時間備用。

研究結(jié)果顯示，靜脈血細胞懸液放置2 h后RBC總數(shù)顯著降低，與之相關(guān)的MCV和HCT在放置1 h后顯著降低；放置4 h后PLT顯著升高，與之相關(guān)的MPV和PCT在放置2 h后顯著升高；放置8 h后WBC總數(shù)和HGB含量變化不明顯。由研究結(jié)果分析，當(dāng)應(yīng)用微量血測定法測定血常規(guī)時，制備好的靜脈血細胞懸液測定RBC時需要在1 h內(nèi)完成，測定與RBC相關(guān)的MCV和HCT則需在30 min內(nèi)進行；測定PLT需在2 h內(nèi)完成，與PLT相關(guān)的PCT和MPV需在1 h內(nèi)進行；測定WBC總數(shù)和HGB含量需在8 h內(nèi)完成即可。綜上所述，研究人員需根據(jù)實驗?zāi)康乃P(guān)注的具體指標(biāo)在一定時間段內(nèi)完成檢測，若同時關(guān)注RBC總數(shù)、WBC總數(shù)、PLT以及HGB含量等主要指標(biāo)，則需在1 h內(nèi)檢測，若主要檢測MCV和HCT兩個指標(biāo)，則需要在30 min內(nèi)完成，這對血液樣本采集人員和檢測人員都提出了更高的要求，需要事先溝通協(xié)調(diào)，盡可能減少放置時間對檢測數(shù)據(jù)的影響。

總之，動物實驗?zāi)康牟煌?，血常?guī)測定指標(biāo)不同，血細胞懸液可放置時間不同，送檢人員應(yīng)根據(jù)所測指標(biāo)及時送檢，同時，檢測人員也應(yīng)該對送檢血樣及時進行檢測，縮短血樣放置時間，為血常規(guī)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性提供保障。此外，血液采集部位、血樣是否溶血、凝血、動物生理狀態(tài)和生活環(huán)境、人員操作是否規(guī)范以及儀器校準(zhǔn)情況等[16-19]也都是影響血常規(guī)檢測結(jié)果的重要因素，這些影響因素對動物血常規(guī)檢測結(jié)果的影響我們將繼續(xù)關(guān)注。