滕若冰,余 鵬，高 漓

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.生殖醫(yī)學(xué)中心；2.泌尿外科，廣西桂林 541000)

前列腺癌是男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在男性惡性腫瘤中發(fā)病率排名第2位，占癌癥相關(guān)死亡的13%[1]。近年來(lái)，前列腺癌發(fā)病率和病死率呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)且高年齡患者比重明顯上升[2- 3]。早期篩查診斷和手術(shù)切除是目前治療早期前列腺癌的主要方法[4- 5]。由于前列腺癌發(fā)病隱匿、容易早期轉(zhuǎn)移，患者就診時(shí)多處于癌癥晚期，體內(nèi)出現(xiàn)局部浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)根治的機(jī)會(huì)[6]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的非編碼RNA，其可在翻譯、翻譯后修飾水平調(diào)控基因的表達(dá)，例如DNA甲基化、基因沉默、組蛋白修飾等，從而發(fā)揮生物學(xué)作用[7]。因此，本研究以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化的lncRNA(lncRNA ATB)作為研究對(duì)象，探討lncRNA ATB在前列腺癌組織中的表達(dá)及其對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，為前列腺癌的發(fā)病機(jī)制研究提供重要的理論依據(jù)和新的思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑 前列腺癌PC3細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Trizol、Lipofectamine 2000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；STAM結(jié)合蛋白樣1(STAMBPL1)抗體、DAPDH抗體購(gòu)自德國(guó)Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1病例標(biāo)本收集 收集58例2016年1月至2018年10月于本院接受手術(shù)的58例前列腺癌患者病理組織及相應(yīng)癌旁正常組織。術(shù)中組織液氮凍存后放入-80 ℃超低溫冰箱中存用。本研究中所有方案獲得了本院倫理委員會(huì)同意并獲得批準(zhǔn)，患者在術(shù)前均簽署了相關(guān)知情同意書(shū)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將狀態(tài)良好的前列腺癌PC3細(xì)胞株在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，條件為37 ℃、5% CO2及100%飽和濕度。待細(xì)胞匯合至70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，采用無(wú)血清的培養(yǎng)基同步化24 h，將細(xì)胞分為si- NC組與si- ATB組，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明，分別轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒和ATB干擾質(zhì)粒。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄PCR(RT- PCR)檢測(cè)ATB和miR- 107的表達(dá) 采用Trizol法提取組織中總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。實(shí)時(shí)定量PCR運(yùn)用SYBR Premix Ex TaqlⅢ試劑盒，儀器使用ABI prism 7300。相應(yīng)引物序列，IncRNA ATB正向引物為5′- TCC GCT TAT TGG TCT ATC GAT- 3′，反向引物為5′- TTC GAT TGG CAC CTA ATT TAC TCG- 3′;GAPDH正向引物為5′- CGA GTC ACA GGT CGC ATA CC- 3′,反向引物為5′- CGA TTC TTA TAA CTT CTA GT- 3′；miR- 107正向引物為5′- AGT TAA CCT CAA GTC GCC TCT A- 3′，反向引物為5′- ATT CAC GGG CTT TAC GCA- 3′。采用2- ΔΔCt法計(jì)算ATB和miR- 107的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖水平的變化 將兩組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC3細(xì)胞用胰蛋白酶消化，配制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后接種于96孔板中，每孔加入MTT溶液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h。孵育后加入二甲基亞砜(DMSO)振蕩溶解，采用自動(dòng)酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下讀取光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 取兩組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC3細(xì)胞用胰酶消化后用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106個(gè)/mL，將細(xì)胞液50 μL加入Transuell小室上室，將Transwell小室置入含500 μL 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)板,在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后觀察膜及孔下細(xì)胞數(shù)。0.5%結(jié)晶紫溶液染色20 min，染色結(jié)束后洗脫殘余結(jié)晶紫溶液，用棉簽擦去基質(zhì)膠和小室內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行拍照、計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取兩組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC3細(xì)胞置于6孔板中，細(xì)胞密度約為8×105個(gè)/孔。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用100 μL槍頭沿直尺垂直于培養(yǎng)板背后的橫線劃線，注意槍頭保持垂直不要偏斜。劃線結(jié)束后采用不含血清培養(yǎng)基洗2～3次，于培養(yǎng)0 h和24 h在鏡下拍照并測(cè)量劃痕寬度。

1.2.7Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)STAMBPL1蛋白表達(dá) 加入含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液，混勻后裂解30 min，提取si- NC與si- ATB組兩組細(xì)胞蛋白。BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠(SDS- PAGE)電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入STAMBPL1和GAPDH抗體后在4 ℃溫度下孵育過(guò)夜。采用羊抗鼠的二抗(1∶1 000稀釋)孵育50 min，TBST液洗滌3次，滴加超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物顯影曝光。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA ATB在前列腺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá) RT- PCR結(jié)果顯示，58例前列腺癌組織及癌旁正常組織中,前列腺癌組織中ATB mRNA表達(dá)水平顯著增加，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

A：MTT實(shí)驗(yàn)；B:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)；C:Transwell實(shí)驗(yàn)；a:P<0.05，與si- NC組比較

圖2沉默lncRNAATB對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞增殖、遷移及侵襲水平的影響

A：miR- 107 RT- PCR結(jié)果分析圖；B:STAMBPL1 Western blot及其結(jié)果分析圖；a:P<0.05，與si- NC組比較

圖3沉默lncRNAATB對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞中miR-107/STAMBPL1信號(hào)通路的影響

2.2前列腺癌組織中l(wèi)ncRNA ATB的表達(dá)水平與前列腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 分析lncRNA ATB的表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果提示：lncRNA ATB的表達(dá)與術(shù)前前列腺特異性抗原(PSA)水平、臨床分期、Gleason評(píng)分及是否轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05),見(jiàn)表1。

2.3沉默lncRNA ATB對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si- NC組相比，si- ATB組前列腺癌PC3細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.4沉默lncRNA ATB對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞中miR- 107/STAMBPL1信號(hào)通路的影響 采用RT- PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默lncRNA ATB對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞中miR- 107的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與si- NC組比較，si- ATB組中miR- 107 mRNA表達(dá)水平明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默lncRNA ATB對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞中STAMBPL1蛋白水平的影響。結(jié)果顯示，與si- NC組相比，si- ATB組STAMBPL1蛋白表達(dá)水平明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

表1 lncRNA ATB表達(dá)水平與前列腺癌患者臨床病理 特征的相關(guān)性(n)

續(xù)表1 lncRNA ATB表達(dá)水平與前列腺癌患者臨床病理 特征的相關(guān)性(n)

3 討 論

目前研究已證實(shí)，人類基因組中僅1%～2%具有蛋白編碼功能，其余均為非編碼序列[8]。其中，lncRNA多位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，主要由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成，可調(diào)控染色質(zhì)重塑、并對(duì)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因進(jìn)行調(diào)控[9- 10]。近年研究已證實(shí)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)某些特定lncRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。許多l(xiāng)ncRNA在前列腺癌中表達(dá)發(fā)生變化，具有診斷與作為治療靶點(diǎn)的潛力，如lncRNA MALAT1可通過(guò)靶向miR- 320b產(chǎn)生作用，從而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖和周期進(jìn)程，其作用機(jī)制可能與AR信號(hào)通路激活有關(guān)[11]；lncRNA Meg3在前列腺癌中呈低表達(dá)，通過(guò)Meg3/miR- 9- 5p/QKI- 5軸影響前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力及細(xì)胞凋亡[12]；lncRNA NAP1L6在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用，可能是影響前列腺癌患者臨床預(yù)后的重要因素[13]。

ATB是位于人第14號(hào)染色體，長(zhǎng)度約80 kb的長(zhǎng)鏈非編碼RNA。ATB由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β)激活，而后者在調(diào)控腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial- mesenchymaltransition，EMT)過(guò)程中具有重要作用[14]。文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)ATB可作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA(ceRNA)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR- 200c，并解除miR- 200c對(duì)其靶基因Twist1的抑制，且通過(guò)ATB/miR- 200c/Twist1軸在乳腺癌中影響細(xì)胞EMT的進(jìn)程[15]；此外，ZHAI等[16]研究發(fā)現(xiàn)ATB在膀胱癌中表達(dá)顯著增加，通過(guò)抑制miR- 126的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)膀胱癌的增殖、遷移和侵襲，這些發(fā)現(xiàn)可為膀胱癌提供潛在的預(yù)后生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。本研究首先對(duì)前列腺癌組織及癌旁正常組織中ATB的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者組織中ATB表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。接下來(lái)，本研究分析了前列腺癌組織中ATB的表達(dá)水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果提示ATB與腫瘤的術(shù)前PSA水平、臨床分期、Gleason評(píng)分及是否轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外，在PC3細(xì)胞中沉默ATB后，細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力明顯降低，提示ATB參與了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，在前列腺癌中可能扮演了“促癌基因”的角色。

STAMBPL1是JAMM家族成員的主要因子，已有相關(guān)研究表明STAMBPL1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[17]。LEE等[18]發(fā)現(xiàn)STAMBPL1基因在淋巴癌細(xì)胞系中上調(diào)，其機(jī)制與病毒復(fù)制密切相關(guān)；LI等[19]研究顯示，在子宮頸癌的HeLa細(xì)胞中，STAMBPL1的甲基化可通過(guò) NF- κB 、TGF- β和PI3K信號(hào)通路途徑導(dǎo)致細(xì)胞增殖和發(fā)揮抗凋亡的作用。miR- 107可通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。研究表明，miR- 107在胃癌和乳腺癌中可分別靶向BDNF和HMGA1基因的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用[20]。在本研究中，沉默ATB后前列腺癌PC3細(xì)胞中miR- 107表達(dá)上調(diào)，STAMBPL1表達(dá)顯著降低。因此，作者推測(cè)沉默ATB表達(dá)抑制了前列腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與調(diào)控miR- 107/STAMBPL1信號(hào)途徑有一定關(guān)聯(lián)。

綜上所述，lncRNA ATB的異常表達(dá)可能與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可能是通過(guò)調(diào)控STAMBPL1的表達(dá)影響前列腺癌PC3細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的能力。本研究了解了ATB在調(diào)節(jié)前列腺癌進(jìn)展中的功能和分子機(jī)制，將為前列腺癌發(fā)病機(jī)制的闡明提供一定的理論基礎(chǔ)和新的思路。