張素輝，沈克飛，許國洋，徐登峰，張成剛，付利芝

（重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌 402460）

近年來，重慶地區(qū)山羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，已成為助推農(nóng)民脫貧致富的重要產(chǎn)業(yè)之一。然而，由于地方山羊養(yǎng)殖規(guī)模與技術(shù)水平參差不齊，山羊相關(guān)疫病對(duì)產(chǎn)業(yè)的影響日益明顯，其中以山羊化膿性感染尤其嚴(yán)重，幾乎遍布于所有羊場(chǎng)。山羊化膿性感染是由化膿菌（Pyogenic bacteria）感染羊受損的皮膚或黏膜而引起的一種傳染性疾病，常為多種病原菌混合感染[1]，表現(xiàn)為體表膿腫和臟器膿腫。其中，尤以化膿隱秘桿菌引起的山羊化膿性肺炎對(duì)山羊產(chǎn)業(yè)的危害嚴(yán)重。

鑒于化膿隱秘桿菌肺炎的廣泛流行[2]，本研究運(yùn)用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的分子診斷方法[3]和血清學(xué)診斷方法[4]對(duì)山羊化膿隱秘桿菌病的流行情況進(jìn)行調(diào)查，并分析發(fā)病原因，為有效控制該病提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 病料的采集 2019年1～10月間，為解決大足、武隆、長(zhǎng)壽3個(gè)區(qū)縣3家山羊養(yǎng)殖場(chǎng)因呼吸道疾病導(dǎo)致羔羊存活率低下的問題，研究人員固定跟蹤3家養(yǎng)殖場(chǎng)的羊群，針對(duì)病死羔羊進(jìn)行解剖，快速采集胸腔內(nèi)整個(gè)肺臟組織，冷藏保存，直接送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將采集的肺臟組織在鄰近病變部位處直接劃開，無菌條件下劃線接種在含10%小牛血清的TSA瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48～72 h后，進(jìn)行細(xì)菌的純化培養(yǎng)、染色鏡檢[5]。

1.3 細(xì)菌的PCR檢測(cè) 挑取分離菌純培養(yǎng)物的單個(gè)菌落接種至含10%小牛血清的TSB 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃120 r/min振蕩培養(yǎng)24～48 h。采用OMEGA Bacterial DNA Kit試劑盒提取細(xì)菌基因組，運(yùn)用針對(duì)化膿隱秘桿菌PLO毒力基因設(shè)計(jì)的引物（上游引物為5′-TTGATAACGGTCCACCACGG-3′，下游引物為5′-CACTGCCACGACCTACAAGT-3′）進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.4 感染性抗體的檢測(cè) 參考本實(shí)驗(yàn)室2018年申請(qǐng)的專利“一種山羊化膿隱秘桿菌感染檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法”[4]進(jìn)行化膿隱秘桿菌感染性抗體的檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 感染情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果 2019年1～10月期間，共采集肺炎病羊20 份肺臟組織進(jìn)行了化膿隱秘桿菌病原感染的診斷分析，結(jié)果見表1。

表1 3家羊場(chǎng)化膿隱秘桿菌肺炎的感染情況

從表1 可見，3 家羊場(chǎng)的羊群感染化膿隱秘桿菌的情況均較嚴(yán)重，尤以長(zhǎng)壽區(qū)的羊場(chǎng)最為嚴(yán)重，化膿隱秘桿菌分離率達(dá)42.9%。

2.2 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果 通過對(duì)病料直接觸片染色鏡檢和常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)，結(jié)果共分離到6株化膿隱秘桿菌，分離率為30%。

圖1 化膿隱秘桿菌PLO毒力基因PCR檢測(cè)結(jié)果

使用化膿隱秘桿菌PLO 特異性引物對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出264 bp的目的片段（圖1），測(cè)序后在GenBank上進(jìn)行比對(duì)，與化膿隱秘桿菌CP012649的相似性大于99%。

2.3 感染性抗體檢測(cè)結(jié)果 對(duì)長(zhǎng)壽區(qū)確診為化膿隱秘桿菌感染的某羊場(chǎng)進(jìn)行抽樣檢測(cè)，共采集血清100份，經(jīng)間接ELISA方法檢測(cè)，得到血清化膿隱秘桿菌抗體陽性樣本31份，說明該場(chǎng)山羊化膿隱秘桿菌的陽性感染率達(dá)31%。

3 討論

3.1 山羊化膿隱秘桿菌的危害 化膿隱秘桿菌屬于一種條件致病菌，主要寄生在動(dòng)物上呼吸道、消化道、生殖道等黏膜上，常導(dǎo)致牛、羊、豬等多種動(dòng)物的化膿性肺炎、肝膿腫、乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎、流產(chǎn)和死胎等疾病[6-8]。本次從有呼吸道癥狀的病死山羊的肺臟（圖2）、炎性淋巴結(jié)（圖3）、膿腫牙齦（圖4）等病灶中均分離到了化膿隱秘桿菌，并明確了其在山羊化膿性病例中的致病性。

圖2 化膿性肺炎：胸腔充滿膿性渾濁積液、肺臟有出血性黏膿性病變

圖3 淋巴結(jié)炎：髖部淋巴結(jié)腫大化膿

圖4 牙齦膿腫：牙齦根部組織潰爛，蓄積大量膿液

3.2 化膿隱秘桿菌病的流行原因 本次調(diào)查顯示，化膿隱秘桿菌病占呼吸道疾病的比例為20%～42.9%，證實(shí)該病已經(jīng)成為山羊呼吸道疾病的重要病原，廣泛存在于當(dāng)?shù)匮蛉褐?。其中尤以長(zhǎng)壽羊場(chǎng)化膿隱秘桿菌血清抗體陽性的比例最大，這與其養(yǎng)殖方式密切相關(guān)。該場(chǎng)采取散養(yǎng)不補(bǔ)飼的饑餓式飼養(yǎng)方式，一天只放牧一次，持續(xù)時(shí)間約為3 h，羊群缺乏營養(yǎng)，機(jī)體抵抗力較弱，一旦遇上氣溫驟降等外界因素變化，羊群就容易發(fā)病，故化膿隱秘桿菌感染率較高。大足羊場(chǎng)采取全舍飼養(yǎng)殖方式，武隆羊場(chǎng)采取舍飼加放牧的養(yǎng)殖方式，企業(yè)管理均較規(guī)范，營養(yǎng)供給較均衡，但后續(xù)調(diào)查羊舍消毒效果時(shí)發(fā)現(xiàn)其圈舍消毒程序還需改進(jìn)，故這兩家養(yǎng)殖場(chǎng)仍存在化膿隱秘桿菌感染。

3.3 山羊化膿隱秘桿菌病的防治 化膿隱秘桿菌為條件性致病菌，多在不良誘因存在的情況下導(dǎo)致羊群發(fā)病，故養(yǎng)殖過程中應(yīng)注意羊群的防寒保暖，保持圈舍清潔、干燥和良好通風(fēng)，保證羊群充足的營養(yǎng)需求，尤其要為羔羊提供優(yōu)質(zhì)飼草，發(fā)現(xiàn)病羊及時(shí)隔離治療或處置，并對(duì)羊舍進(jìn)行嚴(yán)密消毒。

山羊感染化膿隱秘桿菌后主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性消瘦、咳喘、流鼻液等臨床癥狀，病理組織學(xué)變化為化膿性炎癥［9］。如果養(yǎng)殖過程中未及時(shí)觀察到病羊，隨著病程延長(zhǎng)，就會(huì)造成肺臟組織不可逆損傷，即使后期大量用藥羊只也依然死亡。故在山羊養(yǎng)殖過程中，必須仔細(xì)觀察羊群精神狀態(tài)、采食狀態(tài)，有無流鼻液、有無咳喘，盡量做到早發(fā)現(xiàn)、早治療。重慶地區(qū)的山羊化膿隱秘桿菌對(duì)頭孢菌素、桿菌肽、阿奇霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、慶大霉素、卡那霉素等藥物敏感[5]，可選用以上藥物及早治療。

目前，針對(duì)化膿隱秘桿菌病的防控策略強(qiáng)調(diào)“早發(fā)現(xiàn)、早治療”，故在后期需要加強(qiáng)化膿隱秘桿菌病診斷試劑的研制，為盡早確診提供有效產(chǎn)品。同時(shí)，鑒于該病嚴(yán)重影響羔羊的存活率，故應(yīng)加快化膿隱秘桿菌病有效疫苗的研發(fā)，為防控該病提供有效產(chǎn)品。