依 含 黃建勝 李 雪 朱乃碩

(復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438)

近年來(lái)，腫瘤發(fā)病率逐年上升，已成為一類嚴(yán)重危害公眾健康的疾病。與傳統(tǒng)的腫瘤治療手段相比，免疫療法更具有特異性，毒副作用更小。因此針對(duì)免疫檢查點(diǎn)(Immune checkpoint)的調(diào)節(jié)或阻斷劑在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用受到學(xué)界的高度重視，其中程序性細(xì)胞死亡蛋白1(Programmed cell death-1，PD-1，CD279)與CTLA-4(CD152)的發(fā)現(xiàn)被授予2018年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1992年，免疫檢查點(diǎn)PD-1首次被發(fā)現(xiàn)[1]，與其配體PD-L1 (B7-H1或CD274)為一對(duì)重要的介導(dǎo)免疫耐受的分子[2,3]。PD-L1可表達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表面，可與活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，抑制免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[4,5]，PD-1/PD-L1引起的免疫抑制機(jī)制包括促使T細(xì)胞凋亡、失活或者耗竭，上調(diào)IL-10的表達(dá)等[6-9]；目前，抗PD-1/PD-L1單克隆抗體藥物，如Nivolumab、Keytruda、Pembrolizumab和Avelumab等已在抗腫瘤治療效果上取得重大突破[6,10-12]。然而，PD-L1不僅表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面，也表達(dá)在樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等細(xì)胞表面[13,14]，單克隆抗體對(duì)PD-1或PD-L1非選擇性的阻斷作用可能會(huì)引起機(jī)體免疫系統(tǒng)功能紊亂、自身免疫疾病，同時(shí)抗體作為異源性生物大分子，長(zhǎng)期用藥則會(huì)引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體，引起藥物耐受，使得抗體藥物的長(zhǎng)效性受限。目前抗體藥物價(jià)格昂貴，普通患者及其家庭也難以承受。因此，研發(fā)新型的、更加安全有效的小分子藥物依然十分必要。

誘捕寡核苷酸(Decoy oligonucleotide,Decoy-ON)[15]是一類20 bp以下的短鏈DNA或RNA，可以高特異性、高親和性地結(jié)合目標(biāo)蛋白、多肽或胞內(nèi)大分子，通常以內(nèi)吞途徑快速進(jìn)入細(xì)胞，免疫原性小，成本低，是理想的靶向性藥物材料。

人源STAT3 Decoy-ON是15 bp的雙鏈DNA，序列為CATTTCCCGTAAATC。其5′端與3′端分別有三個(gè)核苷酸經(jīng)硫代磷酸酯修飾，通過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞后高效地結(jié)合pSTAT3(KD=122 nmol/L)，并且抑制pSTAT3激活其下游基因表達(dá)[16,17]。STAT3屬于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducer and activator of transcription，STAT)蛋白家族，該蛋白家族是一類調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和分化的轉(zhuǎn)錄因子，STAT3是致癌信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)[18]，被認(rèn)為是癌基因，可以激活下游IRF-1、cyclin D1、IL-10、survivin等基因的表達(dá)[19-21]。在大量人類癌癥組織中可以檢測(cè)到STAT3被激活，體外研究表明抑制STAT3的表達(dá)會(huì)降低多種癌細(xì)胞系的增殖和存活能力[22,23]，而正常細(xì)胞中STAT3處于未激活狀態(tài)，因此它被認(rèn)為是更具特異性且更安全的抗腫瘤治療靶點(diǎn)。此外，STAT3能夠調(diào)控樹突狀細(xì)胞(DCs)、人多能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(hMSCs)中PD-L1的表達(dá)[14,24-26]。STAT3 Decoy-ON靶向作用于pSTAT3后，可阻斷pSTAT3與下游基因啟動(dòng)子上的識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合，抑制cyclin D1、Bcl-xL等腫瘤相關(guān)基因的活化，并增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[16,27]，且免疫原性小，無(wú)明顯毒副作用。以往研究提示，STAT3 Decoy-ON可能是一種具有潛力的抗腫瘤小分子藥物，而在腫瘤細(xì)胞中，其是否能夠通過(guò)靶向pSTAT3而行使對(duì)PD-L1的調(diào)控鮮有報(bào)道。本研究以前列腺癌細(xì)胞DU145為模型，對(duì)STAT3及其下游相關(guān)因子IRF-1對(duì)腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)影響進(jìn)行了研究，證明STAT3 Decoy-ON對(duì)DU145細(xì)胞中免疫調(diào)控分子PD-L1的表達(dá)具有顯著抑制作用，并初步明確其作用機(jī)制，進(jìn)一步揭示了STAT3 Decoy-ON的抗腫瘤功能。

1 材料與方法

1.1材料 人前列腺癌細(xì)胞DU145購(gòu)自ATCC網(wǎng)站，細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM，×100青鏈霉素合劑、2.5%EDTA胰酶(Gibco公司)，TRIzon無(wú)酶分離液(Life公司)，PBS、胎牛血清(維森特公司)，10×電轉(zhuǎn)緩沖液、20×TBS、SDS-PAGE凝膠試劑盒(上海雅酶生物科技有限公司)，PD-L1-FITC熒光抗體(Biolegend公司)，RIPA(Beyotime公司)，抗STAT3抗體、抗PD-L1抗體、抗IRF-1抗體(Abcam公司)，抗GAPDH抗體、兔抗鼠HRP抗體、5×SDS蛋白上樣緩沖液(Beyotime公司)，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBN熒光定量試劑盒(Roche公司)，ECL顯色試劑盒(ThermoFisher公司)，Dual-Luciferase Reporter Assay System(Prome-ga公司)，以上試劑均為商品化產(chǎn)品。STAT3誘捕寡核苷酸由鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。其他常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) DU145細(xì)胞使用添加10%胎牛血清、100 μl/ml雙抗的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2的恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞密度約為80%～90%時(shí)，以2.5%EDTA的胰酶進(jìn)行細(xì)胞消化，按照1∶(2～3)的比例進(jìn)行傳代。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面STAT3 Decoy-ON或PD-L1陽(yáng)性率 6孔板內(nèi)準(zhǔn)備每孔1×106個(gè)腫瘤細(xì)胞，與200 nmol/L FAM標(biāo)記的STAT3 Decoy-ON(PBS稀釋)在37℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，以僅加PBS組細(xì)胞為空白對(duì)照組，無(wú)酶分離液消化細(xì)胞5 min，1 500 r/min離心2 min收集細(xì)胞，棄去上清細(xì)胞培養(yǎng)基，并用PBS充分洗滌細(xì)胞，再次離心收集細(xì)胞，用PBS制成400 μl細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)波長(zhǎng)為488 nm激發(fā)光通道的熒光強(qiáng)度。準(zhǔn)備每孔1×106個(gè)腫瘤細(xì)胞，與500 nmol/L的STAT3 Decoy-ON在37℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h，按照上述步驟收集并洗滌細(xì)胞，100 μl PBS重懸細(xì)胞，加入1 μl PD-L1流式熒光抗體，室溫下避光孵育20 min，PBS洗滌3次，制成400 μl 細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)波長(zhǎng)為488 nm激發(fā)光通道的熒光強(qiáng)度。

1.2.3細(xì)胞免疫熒光 將蓋玻片在無(wú)菌PBS中浸泡洗滌，放入75%酒精中浸泡24 h，無(wú)菌環(huán)境下晾干玻璃片，放入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，鋪入每孔1×105個(gè)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，加入500 nmol/L FAM標(biāo)記的STAT3 Decoy-ON，避光在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h，避免晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板使蓋玻片移位。在避光環(huán)境下，棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用PBS輕柔沖洗細(xì)胞，加入4%多聚甲醛室溫下固定細(xì)胞10 min，PBS洗滌細(xì)胞后加入10 μl DAPI(1∶1 000稀釋)，避光染核20 min，PBS充分洗滌細(xì)胞，將蓋玻片移動(dòng)到載玻片上進(jìn)行封片，激光掃描共聚焦顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，以紫外光定位DAPI的藍(lán)色熒光，以藍(lán)光觀察FAM的綠色熒光。

1.2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 無(wú)酶分離液消化并收集500 nmol/L STAT3 Decoy-ON干預(yù)后腫瘤細(xì)胞，加入200 μl RIPA在冰上裂解細(xì)胞抽提蛋白質(zhì)并定量。蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后，180 V、35 min電轉(zhuǎn)至PVDF膜。將PVDF膜置于搖床上，室溫下在含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉2 h，根據(jù)說(shuō)明書比例稀釋STAT3、PD-L1、IRF-1或內(nèi)參GAPDH一抗，4℃冰箱孵育過(guò)夜，按照說(shuō)明書比例稀釋HRP二抗，室溫下孵育1 h，避光環(huán)境下在PVDF膜上滴加ECL顯色試劑并立即曝光。曝光后的條帶應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，結(jié)果應(yīng)用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行繪圖。

1.2.5qRT-PCR檢測(cè)目的基因mRNA 收集500 nmol/L STAT3 Decoy-ON干預(yù)后的腫瘤細(xì)胞，利用TRIzon法抽提細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度，并立即用Roche反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，-80℃保存待用。應(yīng)用Roche公司SYBN熒光定量試劑盒進(jìn)行相關(guān)基因的定量分析，反應(yīng)條件為：變性95℃ 3 min，擴(kuò)增95℃ 10 s、57℃ 20 s、72℃ 30 s、40個(gè)循環(huán)，溶解曲線測(cè)定95℃ 15 s、60℃ 15 s、梯度升溫到100℃。以β-actin的Ct值為內(nèi)參計(jì)算目的基因Ct值的2-ΔΔCt，得到目的基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果應(yīng)用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行繪圖。qPCR使用引物見表1。

1.2.6PD-L1啟動(dòng)子突變熒光素酶質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 將PD-L1起始密碼子ATG上游的啟動(dòng)子序列(-599 bp至0 bp)克隆至螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferases)質(zhì)粒pGL4.18 [luc2P/Neo]熒光素酶基因的上游。應(yīng)用單引物循環(huán)PCR技術(shù)和環(huán)狀質(zhì)粒PCR技術(shù)將PD-L1啟動(dòng)子上STAT3與IRF-1識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行突變或缺失改造[28]。以海腎熒光素酶(Renilla luciferases)質(zhì)粒pGL4.74[hRluc/TK]的熒光強(qiáng)度作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參。將DU145細(xì)胞鋪入96孔板，應(yīng)用Lipo3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將100 ng重組pGL4.18質(zhì)粒與5 ng pGL4.74質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)腫瘤細(xì)胞，空白pGL4.18質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。36 h后，吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，應(yīng)用Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中兩種熒光素酶的熒光強(qiáng)度：每孔細(xì)胞加入20 μl PLB溶液，再加入100 μl LARⅡ，延遲10 s后上機(jī)檢測(cè)Firefly熒光強(qiáng)度，加入100 μl Stop & Glo Reagent，檢測(cè)內(nèi)參Renilla熒光強(qiáng)度，計(jì)算每孔細(xì)胞Firefly與Renilla熒光強(qiáng)度比值，得到相對(duì)熒光活性(RLAs)，結(jié)果應(yīng)用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1STAT3誘捕寡核苷酸對(duì)DU145細(xì)胞的親和性探究 將FAM熒光標(biāo)記的STAT3 Decoy-ON與DU145細(xì)胞孵育2 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面STAT3 Decoy-ON的陽(yáng)性率(圖1)，圖中紅色曲線表示STAT3 Decoy-ON實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞群，黑色曲線為空白對(duì)照組細(xì)胞群，結(jié)果顯示DU145細(xì)胞表面STAT3 Decoy-ON陽(yáng)性率為(50.93±4.47)%，表明STAT3 Decoy-ON可以有效吸附在DU145細(xì)胞表面。將STAT3 Decoy-ON-FAM與DU145細(xì)胞孵育2 h后激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，DAPI定位細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)，DU145細(xì)胞質(zhì)中存在大量的STAT3 Decoy-ON-FAM(綠色熒光)(圖2)，說(shuō)明STAT3 Decoy-ON能夠有效親和并進(jìn)入DU145細(xì)胞。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)STAT3 Decoy-ON與DU145細(xì)胞親和性Fig.1 Affinity of STAT3 Decoy-ON with DU145 detected by Flow cytometryNote:The STAT3 Decoy-ON-FAM was detected in the FL1 channel.***.P<0.001 vs Blank control.

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)STAT3 Decoy-ON與DU145細(xì)胞親和性(×100)Fig.2 Affinity of STAT3 Decoy-ON with DU145 detected by laser scanning confocal microscopy (×100)

表1 qRT-PCR檢測(cè)引物

Tab.1 Primers of qRT-PCR

GeneForward(5′→3′)Reverse(5′→3′)STAT3GGAGCAGAGATGTGGGAATGCTTGGTGGTGGAGGAGAACTPD-L1GTGGCATCCAAGATACAAACTCTCCTTCCTCTTGTCACGCTCAIRF-1GTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCTACGGTGCACAGGGAATGGCCTGβ-actinAGCAAGCAGGAGTATGACGGTGGGGTGGCTTTTAGGA

2.2STAT3誘捕寡核苷酸對(duì)DU145細(xì)胞STAT3的調(diào)控 將DU145細(xì)胞與STAT3 Decoy-ON進(jìn)行孵育，分別收集干預(yù)24 h、36 h、48 h與72 h 后的細(xì)胞，檢測(cè)STAT3在不同時(shí)間段的mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)量。相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞干預(yù)24 h后STAT3 mRNA水平下調(diào)10.0%，36 h下調(diào)28.1%，48 h下調(diào)33.3%，72 h 下調(diào)8.0%(圖3A)，36 h與48 h下調(diào)作用最顯著(P<0.001)。蛋白質(zhì)Western blot檢測(cè)結(jié)果經(jīng)Image J軟件計(jì)算條帶相對(duì)灰度，36 h與48 h時(shí)STAT3 Decoy-ON對(duì)STAT3蛋白表達(dá)的抑制性顯著(P<0.05)，分別下調(diào)表達(dá)33%與21%(圖3B、C)。說(shuō)明STAT3 Decoy-ON可以下調(diào)STAT3本身的表達(dá)。

圖3 STAT3 Decoy-ON干預(yù)后DU145細(xì)胞STAT3的表達(dá)情況Fig.3 Result of STAT3 expression in DU145 after STAT3 Decoy-ON administrationNote:A.STAT3 mRNA qRT-PCR analysis.B.STAT3 protein Western blot analysis；C.Relative band grey value of Western blot.*.P<0.05 **.P<0.01，***.P<0.001 vs Blank control.

2.3STAT3誘捕寡核苷酸對(duì)DU145細(xì)胞PD-L1的表達(dá)調(diào)控 以500 nmol/L STAT3 Decoy-ON干預(yù)DU145細(xì)胞48 h，無(wú)酶分離液消化并收集細(xì)胞，孵育PD-L1-FITC熒光抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面PD-L1的陽(yáng)性率，圖4中紅色曲線表示寡核苷酸實(shí)驗(yàn)組PD-L1陽(yáng)性細(xì)胞群體，黑色曲線表示空白對(duì)照組PD-L1陽(yáng)性細(xì)胞群體，結(jié)果顯示，DU145細(xì)胞表面PD-L1陽(yáng)性率下降11.3%，相對(duì)于空白對(duì)照組PD-L1下調(diào)44.5%(P<0.001)。說(shuō)明經(jīng)過(guò)STAT3 Decoy-ON干預(yù)后，DU145細(xì)胞表面的PD-L1表達(dá)量可以被顯著下調(diào)。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)STAT3 Decoy-ON干預(yù)后DU145細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)情況Fig.4 Flow cytometry analysis of PD-L1 expression on DU145 after STAT3 Decoy-ON administrationNote:The FITC was detected in the FL1 channel.***.P<0.001 vs Blank control.

用500 nmol/L的STAT3 Decoy-ON與DU145分別孵育24 h、36 h、48 h和72 h，檢測(cè)干預(yù)后的PD-L1 mRNA轉(zhuǎn)錄量。結(jié)果表明(圖5A)24 h后，STAT3 Decoy-ON顯著下調(diào)DU145細(xì)胞PD-L1的轉(zhuǎn)錄(P<0.05)，直到干預(yù)后的72 h 下調(diào)作用依舊顯著。4個(gè)時(shí)間段相對(duì)于對(duì)照組，STAT3 Decoy-ON組PD-L1的mRNA表達(dá)量分別下調(diào)9.2%、61.7%、62.1%與64.6%，其中36 h、48 h與72 h 下調(diào)作用最為顯著(P<0.001)。細(xì)胞經(jīng)干預(yù)后進(jìn)行Western blot分析(圖5B、C)，結(jié)果經(jīng)Image J軟件進(jìn)行條帶相對(duì)灰度值計(jì)算，4個(gè)時(shí)間段PD-L1蛋白表達(dá)分別下調(diào)16.1%(P<0.05)、64.3%(P<0.001)、71.1%(P<0.001)與75.0%(P<0.001)。證明STAT3 Decoy-ON可顯著抑制DU145細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)。

表2 位點(diǎn)突變質(zhì)粒

Tab.2 Plasmids of sites mutation

PlasmidMutation siteBanding site sequence(5′to 3′)Mutation sequence(5′to 3′)pGL599---pGL383STAT3x--599 bp to -384 bppGL252STAT3x--599 bp to -253 bppGL222STAT3x/a--599 bp to -223 bppGL131STAT3x/a;IRF-1α/β--599 bp to -132 bppGL599-mIRF1αIRF-1αTTTCACTTTCTGTTTCATTTCTGTAACCTTCTGTTTCATTTCpGL599-mIRF1βIRF-1βATACCTAAACTGAAAGCTTCCATACCTAAGCTTACAGCTTCCpGL599-DmIRF1IRF-1α/βTGTTTCACTTTCTGTTTCATTTCTAAACTGAAAGCTTCCTGTGTAACCTTCTGTTTCATTTCTAAGCTTACAGCTTCCpGL599-mSTATaSTAT3aTTTACAAGAAATCGACAACTCApGL252-mSTATaSTAT3aTTTACAAGAAATCGACAACTCApGL599-mSTATxSTAT3xTTTATCAGAAAGGGGGACGCCTTTCTGATAAATAGATCACTCAGGGGGACGCCTAGCTGATGCA

圖5 STAT3 Decoy-ON干預(yù)后DU145細(xì)胞PD-L1的表達(dá)情況Fig.5 Result of PD-L1 expression in DU145 after STAT3 Decoy-ON administrationNote:A.PD-L1 mRNA qRT-PCR analysis；B.PD-L1 protein Western blot analysis；C.Relative grey value of Western blot.*.P<0.05 or ***.P<0.001 vs Blank control.

2.4STAT Decoy-ON調(diào)控PD-L1表達(dá)的機(jī)制探究 干擾素調(diào)節(jié)因子1(Interferon regulatory factor-1,IRF-1)與PD-L1的表達(dá)密切相關(guān)。以JASPAR軟件(85%閾值)預(yù)測(cè)PD-L1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 000 bp范圍內(nèi)STAT3和IRF-1識(shí)別位點(diǎn)(圖6)，在-208 bp至-188 bp、-151 bp至-131 bp處分別存在兩個(gè)IRF-1識(shí)別位點(diǎn)，將-208 bp至-188 bp位點(diǎn)稱為IRF1α位點(diǎn)，將-151 bp至-131 bp位點(diǎn)稱為IRF1β。在-415 bp至-405 bp、-394 bp至-384 bp、-233 bp至-223 bp處分別存在三個(gè)STAT3識(shí)別位點(diǎn)，將-233 bp至-223 bp位點(diǎn)稱為STAT3a，-415 bp至-405 bp與-394 bp至-384 bp兩個(gè)位點(diǎn)稱為STAT3x。將PD-L1啟動(dòng)子序列(-599 bp至0 bp)克隆至Firefly熒光素酶質(zhì)粒pGL4.18中，并分別構(gòu)建STAT3a、STAT3x、IRF1α和IRF1β識(shí)別位點(diǎn)突變或截短的PD-L1啟動(dòng)子熒光素酶質(zhì)粒(表2)，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析STAT3和IRF-1對(duì)PD-L1的表達(dá)調(diào)控作用。

由圖7A可見，IRF1α和IRF1β單識(shí)別位點(diǎn)突變(pGL599-mIRF1α和pGL599-mIRF1β)時(shí)， PD-L1啟動(dòng)子活性分別下調(diào)37.6%與29.7%(P<0.01與P<0.05)；當(dāng)IRF-1雙識(shí)別位點(diǎn)突變(pGL599-DmIRF1)時(shí)，PD-L1啟動(dòng)子活性下降80.9%(P<0.001)。該結(jié)果說(shuō)明IRF-1是PD-L1表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其識(shí)別位點(diǎn)的突變顯著抑制PD-L1的轉(zhuǎn)錄活性。

圖6 PD-L1啟動(dòng)子STAT3、IRF-1結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of STAT3,IRF-1 binding site on PD-L1 promoter

STAT3x位點(diǎn)突變(pGL559-mSTAT3x、pGL383或pGL252)分別顯著下調(diào)PD-L1啟動(dòng)子活性達(dá)41.5%、48.6%與41.9%(P<0.01、P<0.001與P<0.01)(圖7B)。STAT3a位點(diǎn)突變(pGL599-mSTAT3a)顯著下調(diào)啟動(dòng)子活性51.0%(P<0.001)。STAT3a/x識(shí)別位點(diǎn)同時(shí)突變(pGL252-mSTAT3a或pGL222)分別下調(diào)啟動(dòng)子活性41.5%與63.1%(P<0.01與P<0.001)。證明STAT3x或STAT3a識(shí)別位點(diǎn)的缺失或突變皆可顯著下調(diào)PD-L1啟動(dòng)子活性。STAT3與IRF-1識(shí)別位點(diǎn)全部突變(pGL131)下調(diào)啟動(dòng)子活性達(dá)70.6%(P<0.001)。由以上結(jié)果可推論，阻斷STAT3結(jié)合其PD-L1啟動(dòng)子上的識(shí)別位點(diǎn)可以直接抑制PD-L1的表達(dá)，同時(shí)也證實(shí)IRF-1對(duì)PD-L1的表達(dá)有著重要的調(diào)控作用。

圖7 STAT3與IRF-1結(jié)合位點(diǎn)突變或缺失PD-L1啟動(dòng)子的活性Fig.7 Activity of PD-L1 promoter with mutation or deficiency of STAT3 and IRF-1 binding sitesNote:A.PD-L1 promotor activity with mutation or deficiency of IRF-1 binding site；B.PD-L1 promotor activity with mutation or deficiency of STAT3x and STAT3a binding site.*.P<0.05,**.P<0.01 or ***.P<0.001 vs pGL599.

將STAT3 Decoy-ON與DU145細(xì)胞孵育48 h后，檢測(cè)IRF-1的表達(dá)情況。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖8A)IRF-1的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)59.5%(P<0.001)，同時(shí)，通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖8B)IRF-1的蛋白質(zhì)表達(dá)量有明顯下降。說(shuō)明STAT3Decoy-ON可調(diào)控DU145細(xì)胞中IRF-1的表達(dá)。由此證明，在DU145細(xì)胞內(nèi)STAT3 Decoy-ON可能通過(guò)對(duì)STAT3的下調(diào)或阻斷直接抑制PD-L1的表達(dá)，同時(shí)，還可以介導(dǎo)IRF-1的信號(hào)通路對(duì)PD-L1進(jìn)行調(diào)控(圖9)。

圖8 STAT3 Decoy-ON干預(yù)后DU145細(xì)胞IRF-1的表達(dá)情況Fig.8 Result of IRF-1 expression after STAT3 Decoy-ON ad ministrationNote:A.IRF-1 mRNA qRT-PCR analysis，***.P<0.001 vs Blank control；B.IRF-1 protein Western blot analysis.

圖9 STAT3 Decoy-ON調(diào)控前列腺癌細(xì)胞(DU145)中PD-L1表達(dá)的機(jī)制模式圖Fig.9 Proposed regulatory mechanism of PD-L1 expression with the STAT3 Decoy-ON in Prostate cancer (DU145) cells

3 討論

免疫逃逸是腫瘤治療的一大難點(diǎn)，PD-1/PD-L1是腫瘤免疫耐受形成的關(guān)鍵分子，現(xiàn)已證實(shí)PD-L1可在多種實(shí)體腫瘤中過(guò)度表達(dá)并幫助腫瘤進(jìn)行免疫逃逸，如頭頸部鱗癌、乳腺瘤、肺癌、胃癌、前列腺癌、霍奇金淋巴瘤和黑色素瘤等[4,29-31]，因此，PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)阻斷劑在腫瘤免疫治療方面被寄予厚望；美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)已經(jīng)批準(zhǔn)了多種抗PD-1/PD-L1抗體藥物，然而單克隆抗體對(duì)PD-1/PD-L1無(wú)差別的阻斷很可能會(huì)打破機(jī)體自身免疫平衡引發(fā)免疫系統(tǒng)疾病[3]。正因如此，開發(fā)一種更安全的PD-L1靶向抑制藥物是十分必要的。Decoy-ON作為短鏈的DNA或RNA，開發(fā)為小分子藥物具有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：①可與目標(biāo)蛋白質(zhì)高度特異性結(jié)合；②分子量小，更易突破組織屏障到達(dá)病灶處；③免疫原性小，不刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，無(wú)明顯毒副作用；④易于合成與制備，且生產(chǎn)成本低廉。其中STAT3 Decoy-ON與pSTAT3可以高效親和，抑制pSTAT3激活下游癌基因的表達(dá)，發(fā)揮一定的抗腫瘤功效，是一個(gè)極具開發(fā)潛力的新型抗腫瘤小分子藥物。

本研究中發(fā)現(xiàn)STAT3 Decoy-ON可以有效地進(jìn)入前列腺癌細(xì)胞DU145，顯著下調(diào)DU145細(xì)胞STAT3癌基因的表達(dá)，在干預(yù)36 h與48 h下調(diào)作用最顯著。經(jīng)STAT3 Decoy-ON干預(yù)后，DU145細(xì)胞表面的PD-L1顯著下調(diào)，給藥后24 h、36 h、48 h與72 h 均可顯著抑制DU145細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，結(jié)合寡核苷酸藥物本身優(yōu)勢(shì)，提示STAT3 Decoy-ON可能具有被開發(fā)為針對(duì)PD-L1免疫檢查點(diǎn)抗腫瘤藥物的潛力。而STAT3 Decoy-ON作為寡核苷酸小分子，如何使其功能更具長(zhǎng)效性，其在動(dòng)物模型中能否有效抑制PD-L1的表達(dá)有待繼續(xù)研究，可下一步的討論。

IRF-1是一個(gè)重要的多功能轉(zhuǎn)錄因子，在肺癌、黑色素瘤等細(xì)胞中IRF-1與 PD-L1的高表達(dá)密切相關(guān)[32,33]，后續(xù)研究證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞中interferon gamma-JAK1/JAK2-STAT1/STAT2/STAT3-IRF1是調(diào)控PD-L1表達(dá)的重要信號(hào)通路之一[34,35]。本研究構(gòu)建了PD-L1啟動(dòng)子上STAT3與IRF-1識(shí)別位點(diǎn)缺失或突變的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)STAT3識(shí)別位點(diǎn)缺失或突變時(shí)，PD-L1啟動(dòng)子活性顯著下調(diào)，提示STAT3 Decoy-ON可能通過(guò)阻斷pSTAT3結(jié)合PD-L1啟動(dòng)子上的識(shí)別位點(diǎn)直接下調(diào)PD-L1的表達(dá)。當(dāng)IRF-1識(shí)別位點(diǎn)缺失或突變時(shí)皆顯著下調(diào)PD-L1啟動(dòng)子活性；以STAT3 Decoy-ON干預(yù)細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)IRF-1的表達(dá)量被顯著下調(diào)，證實(shí)IRF-1是前列腺癌細(xì)胞株中STAT3下游影響PD-L1表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，證明了STAT3 Decoy-ON介導(dǎo)STAT3與IRF-1協(xié)同調(diào)控DU145細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，進(jìn)一步揭示了STAT3 Decoy-ON抗腫瘤的功能與機(jī)制。

STAT3 Decoy-ON作為一種新的研究方向與技術(shù)路線，盡管仍有許多問題尚待探究，但其作為小分子候選藥物的優(yōu)勢(shì)不容忽視，在治療實(shí)體腫瘤方面可能具有很大的潛力。