李文玲， 雷燕芬， 王成輝， 嚴繼舟

(1. 上海海洋大學 海洋生態(tài)系統(tǒng)和神經(jīng)科學研究所∥農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室, 上海 201306; 2. 上海海洋大學 水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心, 上海 201306)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)又名河蟹，是我國主要的養(yǎng)殖經(jīng)濟蟹類.河蟹因其獨特的口味且具有較高的營養(yǎng)價值而深受消費者的喜歡.河蟹富含豐富的脂類物質(zhì)，其肝胰腺是脂類的代謝中心，脂類物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)高達32.79%[1].成永旭等[2]的研究表明：肝胰腺中儲存的脂類主要是中性脂，磷脂質(zhì)量分數(shù)很少，僅占總脂的10%～20%，并且這些磷脂含有不同于植物磷脂的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)成分.脂類是構成生物有機體的主要成分之一，對機體具有重要的生物學作用和生理學調(diào)控功能[3-4].活性脂類在細胞內(nèi)的含量較少卻具有重要而獨特的生物學功能，是近年來研究的重點和熱點.過去的二十年里，越來越多的人意識到某些疾病與脂類的缺乏有關[5].河蟹肝胰腺中脂肪酸的組成主要有: 棕櫚酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸.其中多不飽和脂肪酸因其獨特的生物活性,已經(jīng)進入生物制藥和營養(yǎng)保健領域.近來的研究表明，多不飽和脂肪酸還參與控制細胞的增殖和分化,是各種脂肪代謝酶和相關蛋白進行基因表達的一種重要調(diào)節(jié)因子.

目前，關于河蟹肝胰腺脂類功能的研究僅限于脂肪酸類，對于肝胰腺中其他脂類物質(zhì)在細胞水平的研究鮮有報道.本研究前期的實驗通過質(zhì)譜檢測了河蟹肝胰腺中的脂類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其中含有C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸，N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯，磷酰膽堿和棕櫚酰肉堿4種活性脂類.C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸是一種新型的具有生物活性的鞘脂類.磷酰膽堿由一個帶負電的磷酸基團和一個帶正電的膽堿小基團組成，是血小板活化因子的一部分，是一種沒有甘油骨架的磷脂[6].C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸和磷酰膽堿都屬于磷脂，主要參與細胞膜的組成.棕櫚酰肉堿是一種參與脂肪酸代謝的長鏈?；鈮A, 可刺激caspase 3、7和8的活性,在細胞凋亡過程中棕櫚酰肉堿的水平會升高[7].N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯屬于內(nèi)脂類化合物，該類化合物大都具有潛在的生物活性.本研究初步探究河蟹肝胰腺中4種脂類物質(zhì)對斑馬魚胚胎成纖維細胞(PAC2)細胞增殖、細胞毒性和亞細胞結構的影響，以期為活性脂類功能的營養(yǎng)基因組學深入研究提供基礎和方法借鑒.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

PAC2細胞引進于美國國立衛(wèi)生研究院，C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸、N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯、磷酰膽堿購于美國Cayman chemical公司，棕櫚酰肉堿購于美國Sigma公司，CCK-8試劑盒和LDH試劑盒購于碧云天生物技術有限公司，二甲基亞砜(DMSO)、線粒體標記試劑盒和溶酶體標記試劑盒購于上海生工生物有限公司，細胞培養(yǎng)箱和超凈工作臺購于美國Thermo Scientific公司，熒光倒置顯微鏡購于日本Olympus公司，離心機購于美國Eppendorf公司，酶標儀購于美國BioTek公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

PAC2細胞常規(guī)培養(yǎng)在含有質(zhì)量分數(shù)為10%胎牛血清的L15培養(yǎng)液中，置于32 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[8].每48 h傳代一次，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗.

A：C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸; B:N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯; C:磷酰膽堿； D:棕櫚酰肉堿

A： C-8 Ceramide-1-phosphate; B: N-dodecanoyl-L-Homoserine lactone; C: Oleyloxyethyl Phosphorylcholine; D: Palmitoyl-L-carnitine inhibited

圖1 脂類的化學結構

Fig.1 Chemical structures of lipids

1.2.2 細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)檢測

取對數(shù)生長期的PAC2細胞消化，調(diào)整細胞懸液濃度為5×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL.貼壁后換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h使細胞同步化.吸去孔中的上清液，用PBS緩沖液清洗1～2次.分別加入質(zhì)量濃度分別為1.25、5、20、80 μg/μL的4種脂類100 μL，同時設立陰性對照組(相同質(zhì)量濃度脂類溶解介質(zhì)的DMSO)和空白對照組(無細胞的培養(yǎng)基).將96孔培養(yǎng)板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h和36 h，棄上清并用PBS緩沖液清洗2次.每孔加入10 μL CCK-8和90 μL無血清的L15培養(yǎng)基，32 ℃孵育過夜，用酶標儀(microplate reader)在450 nm處測定各孔的光密度，每個組均有3個復孔[9].

1.2.3 乳酸脫氫酶(LDH)檢測

LDH釋放檢測同CCK-8檢測一樣, 先用不同質(zhì)量濃度的4種脂類處理PAC2細胞24和36 h，同時設立空白對照組、陰性對照組和樣品最大酶活性對照組(未經(jīng)脂類處理的用于后續(xù)裂解的細胞).到達預定檢測時間，將96孔培養(yǎng)板400 g離心5 min，分別取上清液120 μL，加入到新的96孔板對應孔中進行胞外LDH釋放檢測(細胞沉淀用于后續(xù)分析).加入60 μL LDH檢測工作液，混勻.室溫避光孵育2 h，用酶標儀在490 nm測吸光度值，所有組別均有3個復孔.

上述細胞沉淀用于胞內(nèi)總LDH含量的檢測.加入150 μL用PBS稀釋了10倍的LDH釋放試劑工作液，搖晃混勻，32 ℃孵育1 h.到達預定時間，將96孔培養(yǎng)板400 g離心5 min.取120 μL上清液加入到新的96孔培養(yǎng)板對應孔中，加入60 μL LDH檢測工作液混勻并避光孵育2 h，在490 nm測吸光度值.

1.2.4 線粒體和溶酶體完整性檢測

取5×104/mL對數(shù)生長期的PAC2細胞100 μL接種到96孔板中，用4種脂類藥物干預PAC2細胞24 h，同時設置陰性對照組.加入等體積的溶酶體(紅色)和線粒體(綠色)工作液，32 ℃孵育1 h.然后棄上清，用VL15培養(yǎng)基∶VPBS=1∶1的緩沖液洗滌3次.分別用TRITC和FITC濾光器的熒光顯微鏡(OLYMPUS TH4-200)觀察細胞并拍照.

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果與分析

2.1 4種脂類對PAC2細胞增殖及細胞活力的影響

檢測藥物對細胞的毒性，通常采用的方法是藥物加入后測定細胞的存活與增殖情況[12].本實驗通過CCK-8分別檢測了不同質(zhì)量濃度的4種脂類對PAC2細胞增殖和細胞活性的影響，結果分析用相對細胞數(shù)量(實驗組光密度與對照組光密度的比值)表示.24 h的結果顯示(圖2A)，在質(zhì)量濃度1.25 μg/mL時，4種脂類物質(zhì)對PAC2細胞計數(shù)均未表現(xiàn)出明顯的改變.在質(zhì)量濃度5、20和80 μg/mL的磷酰膽堿顯著抑制PAC2細胞增殖，表現(xiàn)為相對細胞數(shù)量比對照組明顯降低；C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸和棕櫚酰肉堿在質(zhì)量濃度20和80 μg/mL時也表現(xiàn)為相對細胞數(shù)量的顯著降低，且呈現(xiàn)劑量依賴性.而N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯在質(zhì)量濃度5和80 μg/mL時對PAC2細胞表現(xiàn)為極顯著的促進細胞增殖的活性.

培養(yǎng)36 h的觀察顯示(圖2B)，在1.25、5、20和80 μg/mL質(zhì)量濃度下C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸、磷酰膽堿和棕櫚酰肉堿對PAC2細胞均表現(xiàn)為抑制細胞增殖，與24 h的實驗結果基本吻合.但N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯表現(xiàn)為抑制細胞增殖的活性，與24 h的實驗結果相反.

A: 24 h CCK-8分析; B: 36 h CCK-8分析. 與對照組比較，1)P<0.01；2)P<0.05.A: 24 h CCK-8 assay; B: 36 h CCK-8 assay. Compared with control group, 1)P<0.01; 2)P<0.05.

2.2 4種脂類物質(zhì)對細胞代謝和細胞生長的影響

細胞膜結構的損壞會導致胞漿內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液中，其中包括酶活性較穩(wěn)定的乳酸脫氫酶.乳酸脫氫酶釋放檢測被認為是細胞膜完整性檢測的重要指標，根據(jù)胞漿中乳酸脫氫酶能通過受損細胞膜漏出的特點[12]，通過檢測細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶的活性，可實現(xiàn)對細胞膜完整性的定量分析.結果分析用相對LDH含量(實驗組光密度與對照組光密度的比值)表示.

使用不同質(zhì)量濃度的C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸處理PAC2細胞.細胞處理24 h的結果顯示(圖3A)：與對照組相比，培養(yǎng)液中LDH的相對含量在1.25和5 μg/mL質(zhì)量濃度下均顯著降低，在20和80 μg/mL質(zhì)量濃度下均顯著升高.36 h的結果顯示(圖3B)：培養(yǎng)液中LDH的相對含量在5、20和80 μg/mL質(zhì)量濃度下均顯著升高，并存在劑量依賴.

使用不同質(zhì)量濃度的N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯處理PAC2細胞.細胞處理24 h的結果顯示：培養(yǎng)液中LDH的含量在1.25、5、20、80 μg/mL質(zhì)量濃度下均顯著高于對照組；但36 h的結果顯示：培養(yǎng)液中LDH的相對含量在5和20 μg/mL質(zhì)量濃度下沒有明顯變化，在1.25和80 μg/mL質(zhì)量濃度下與24 h的實驗結果一致.

使用不同質(zhì)量濃度的磷酰膽堿處理PAC2細胞.細胞處理24 h和36 h的結果基本一致：培養(yǎng)液中LDH的相對含量在1.25 μg/mL質(zhì)量濃度下沒有顯著變化，而5、20、80 μg/mL質(zhì)量濃度下均顯著升高，且存在劑量依賴.

使用不同質(zhì)量濃度的棕櫚酰肉堿處理PAC2細胞.細胞處理24 h和36 h的結果基本一致：培養(yǎng)液中LDH的相對含量在1.25、5和80 μg/mL質(zhì)量濃度下均顯著升高.但20 μg/mL質(zhì)量濃度下培養(yǎng)液中LDH的相對含量僅在36 h表現(xiàn)為顯著升高，24 h未發(fā)生顯著變化.

A: 24 h LDH釋放分析; B: 36 h LDH釋放分析. 與對照組比較，1)P<0.01；2)P<0.05.A: 24 h the release of LDH assay; B: 36 h the release of LDH assay. Compared with control group, 1)P<0.01; 2)P<0.05.

細胞內(nèi)總LDH的含量一方面可以反映細胞糖酵解代謝生成乳酸的能力，另一方面得以間接反應細胞數(shù)量的多少.結果分析用相對LDH含量表示.C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸和磷酰膽堿處理的PAC2細胞24 h(圖4A)和36 h(圖4B)的實驗結果基本一致：在1.25 μg/mL質(zhì)量濃度下細胞內(nèi)總LDH含量沒有顯著變化；在5 μg/mL質(zhì)量濃度下細胞內(nèi)總LDH相對含量顯著升高；在20和80 μg/mL質(zhì)量濃度下細胞內(nèi)總LDH相對含量顯著降低.N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯處理PAC2細胞24 h和36 h的實驗結果基本一致：在1.25 μg/mL質(zhì)量濃度下細胞內(nèi)總LDH含量顯著下降；在5 μg/mL質(zhì)量濃度下細胞內(nèi)總LDH含量沒有顯著變化；在80 μg/mL質(zhì)量濃度下細胞內(nèi)總LDH含量顯著升高.棕櫚酰肉堿處理PAC2細胞24 h和36 h的實驗結果顯示：在1.25、20、80 μg/mL質(zhì)量濃度下細胞內(nèi)總LDH相對含量均極顯著降低，但5 μg/mL的質(zhì)量濃度下僅24 h時細胞內(nèi)總LDH含量有顯著降低.

A: 24 h LDH 分析; B: 36 h LDH 分析. 與對照組比較，1)P<0.01；2)P<0.05.A: 24 h LDH assay; B: 36 h LDH assay. Compared with control group, 1)P<0.01; 2)P<0.05.

2.3 線粒體和溶酶體的形態(tài)結構觀察

線粒體和溶酶體對細胞能量和脂類代謝以及維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用，在很多疾病中都觀察到他們的功能缺陷.線粒體和溶酶體通過RAB7 GTP酶的作用相互交流，對實現(xiàn)細胞的完整功能具有重要作用[13].為了進一步驗證4種脂類物質(zhì)是否會影響PAC2細胞中溶酶體和線粒體的形態(tài)，本研究分別用溶酶體和線粒體專屬染料對質(zhì)量濃度為80 μg/mL的4種脂類處理后的PAC2細胞進行染色.結果顯示：陰性對照組的溶酶體和線粒體均呈現(xiàn)單層完整的形態(tài)結構；N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯組的溶酶體和線粒體與對照組相似，呈現(xiàn)單層完整的形態(tài)結構；C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸組溶酶體發(fā)生粘連，線粒體拖著一個纖長的尾巴；磷酰膽堿組的溶酶體出現(xiàn)粘連和聚集，線粒體發(fā)生聚集且由橢圓形轉變?yōu)樗笮?；棕櫚酰肉堿組溶酶體出現(xiàn)粘連，線粒體的體積變大(圖5).

嵌入圖是細胞的放大圖. 標尺:50 μmInsets show magnification of individual cells. Scalebar: 50 μm.

3 討論

脂類物質(zhì)不僅為機體提供能量，而且參與細胞發(fā)育及凋亡等多種生物過程的調(diào)節(jié).河蟹可食用部分的脂類物質(zhì)含量豐富，對人類健康有益的生物活性物質(zhì)和功能性成分也越來越受到研究者的關注.

神經(jīng)酰胺-1-磷酸(ceramide-1-phosphate, C1P)是神經(jīng)酰胺經(jīng)過神經(jīng)酰胺激酶(ceramide kinase, CERK)磷酸化合成的具有生物活性的鞘脂類.C1P是細胞生長、生存、遷移和炎癥的關鍵調(diào)節(jié)因子[14-15]. 一些資料表明C1P通過刺激DNA的合成和細胞分裂促進有絲分裂，同時抑制絲氨酸棕櫚酰轉移酶(serine palmitoyltransferase, SPT)活性和神經(jīng)酰胺積累而抑制細胞凋亡[16-18].本實驗用胚胎成纖維細胞試驗，結果表明C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸抑制細胞增殖，改變細胞膜結構的完整性.特別在20 μg/mL及以上質(zhì)量濃度時，胞外LDH含量增高，胞內(nèi)LDH含量降低，同時使亞細胞水平的線粒體和溶酶體形態(tài)結構發(fā)生了改變.這些結果說明C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸的作用可能具有組織細胞特異性.

N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯可以特異性誘導粒細胞和單核細胞的凋亡，并且在較低質(zhì)量濃度下有明顯的劑量依賴性.除了細胞毒性的作用外，還可以改變?nèi)梭w的細胞循環(huán)和新陳代謝[19].有報道稱來自綠膿桿菌的3-oxo-N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯具有促凋亡的活性[20].在本實驗中，N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯處理的PAC2細胞，其胞外LDH的釋放以及胞內(nèi)總LDH含量都增加，說明N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯促進細胞糖酵解代謝的同時改變了細胞膜結構的通透性.結合胞內(nèi)和胞外LDH含量的變化，以及CCK-8在24和36 h出現(xiàn)相反的實驗結果，說明N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯增強糖酵解代謝和乳酸生成，并且逐漸抑制線粒體的有氧氧化.

磷酰膽堿是磷脂酶A2的抑制劑[21]，但磷酰膽堿的細胞毒性活性尚不清楚，其對亞細胞結構變化的研究鮮有報道.在本研究中，磷酰膽堿表現(xiàn)為抑制細胞增殖和增加胞外LDH釋放，說明磷酰膽堿對細胞膜有一定程度的損壞，同時能改變線粒體和溶酶體的形態(tài)結構.

棕櫚酰肉堿可以促進脂肪酸在氧化過程中從細胞質(zhì)轉移到線粒體中.Tominaga等[22]的研究表明過量的外源性棕櫚酰肉堿-長鏈飽和脂肪酸中間體可能在棕櫚酰肉堿和棕櫚酰輔酶A之間以不同方式擾亂線粒體的功能.Vescovi等[23]的研究表明棕櫚酰肉堿以劑量依賴性的方式抑制黑色素瘤細胞的生長.本實驗結果表明棕櫚酰肉堿抑制細胞增殖并且存在劑量依賴性，并使線粒體和溶酶體的形態(tài)結構發(fā)生了改變，這與先前的研究結論一致.同時本實驗也表明，棕櫚酰肉堿對細胞膜的損傷有嚴格的質(zhì)量濃度限制.

本實驗從細胞水平和亞細胞水平相互驗證4種脂類對PAC2細胞的影響.CCK-8檢測利用細胞線粒體內(nèi)的脫氫酶能將檢測試劑內(nèi)的唑鹽還原成橙黃色的甲瓚，甲瓚的生成量與脫氫酶的活性呈正相關.因此，對甲瓚溶液進行比色測定即可檢測細胞毒性和細胞增殖[24].LDH 存在于細胞漿中[25]，膜結構改變常會出現(xiàn)細胞膜完整性受損和滲漏現(xiàn)象，通過檢測胞外LDH釋放的活性可以評估細胞膜的受損程度.同時LDH與惡性腫瘤密切相關，Warburg效應是腫瘤細胞能量代謝的重要特征之一，Warburg效應不僅增強了糖酵解作用，同時通過將丙酮酸轉化為乳酸來抑制線粒體的氧化磷酸化.缺氧情況下，惡性腫瘤細胞中的LDH催化丙酮酸生成乳酸，使糖酵解速率提升，形成的酸性微環(huán)境對LDH形成負反饋調(diào)節(jié)[26-28].本實驗利用CCK-8檢測和胞內(nèi)胞外LDH檢測，一方面可以反映細胞數(shù)量的變化，另一方面可以評估葡萄糖分解途徑：糖酵解和三羧酸循環(huán)有氧氧化比例.另外，通過線粒體和溶酶體結構檢測進一步驗證細胞膜穩(wěn)定性和線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)能量代謝的變化.

綜上所述，河蟹肝胰腺中的4種脂類物質(zhì)對PAC2細胞所表現(xiàn)出的細胞增殖和細胞毒性與細胞線粒體和溶酶體形態(tài)結構的完整性之間存在一定的聯(lián)系，揭示它們具有明顯的生物活性，能影響細胞代謝和生長.顯示天然活性物質(zhì)應用于臨床治療的可能性，促進了河蟹脂類活性物質(zhì)研究的發(fā)展.進一步研究這些脂類對細胞凋亡和細胞周期的影響將有助于揭示它們的生物活性作用機制.

致謝:感謝上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院和神經(jīng)科學研究所的老師和同學，以及吳昊、劉益寧老師和朱雙光同學對本實驗課題研究上的技術幫助.