林晏廷, 徐季旗, 陳潔

(暨南大學 附屬第一醫(yī)院 泌尿外科， 廣東 廣州 510632)

神經元正五聚體蛋白(neuronal pentraxins，NPTXs)是一類與C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)和血清淀粉樣蛋白P(serum amyloid P，SAP)具有同源性的蛋白家族，家族成員包括NPTX1、NPTX2和NPTXR．NPTX1僅在神經系統(tǒng)的大腦皮質、小腦神經元和海馬等表達，而神經元正五聚體蛋白2(neuronal pentraxin-2,NPTX2)則不局限于神經系統(tǒng)，還可以表達于睪丸、胰島、腎上腺等，且在睪丸、胰島中表達最高[1]．其對促進興奮性突觸的形成和突觸發(fā)育過程中的可塑性發(fā)揮重要作用[2]．有研究顯示NPTX2的異常表達以及高甲基化等與帕金森病[3]、阿爾茲海默病[4-5]、神經母細胞瘤[6-7]、結直腸癌[8]、胰腺癌[9-10]等的發(fā)生發(fā)展皆有一定相關性，并可通過脫甲基化或抑制其過表達等方式影響腫瘤的增殖及遷移，使其有望成為腫瘤早期診斷、治療及預后的生物標記物．

腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是來源于腎實質小管上皮細胞的腫瘤，約占腎臟惡性腫瘤的80%～90%[11-12]．目前已有研究指出NPTX2的表達可能與ccRCC的發(fā)生、發(fā)展有關[13-14]，但由于研究方法、樣本例數及人群的差異，尚不能評價其結論一致性．本研究通過挖掘多個數據庫，以大數據分別從mRNA水平和蛋白質水平上對NPTX2在正常腎組織和ccRCC組織中的表達情況進行薈萃分析，并分析其表達與ccRCC患者預后的關系．

1 資料與方法

1.1 數據庫檢索

1.1.1 Oncomine數據庫

Oncomine 數據庫是一個癌癥基因芯片數據庫和整合數據挖掘平臺，可以對所選擇的基因表達譜做可視化分析[15]．本研究設置檢索條件如下：①Gene：NPTX2；②Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysis；③Cancer Type：Kidney Cancer；④Cancer Type：Clear Cell Renal Cell Carcinoma；⑤Data Type：mRNA；⑥Threshold By：P-value<1E-4；Fold Change>2；Gene Rank：Top 10%．

1.1.2 GEPIA 數據庫

GEPIA 數據庫基于TCGA和GTEx數據庫的 8 587個正常組織樣本，9 736個腫瘤組織樣本的RNA測序表達數據，包含33種惡性腫瘤[16]，可做特定基因在正常組織和腫瘤組織中的差異表達分析．本研究選擇使用TCGA數據驗證Oncomine數據庫的分析結果，并且進一步分析NPTX2與ccRCC病理分期及預后的相關性．

1.1.3 人類蛋白質表達圖譜

人類蛋白質表達圖譜(human protein atlas，HPA)是一個基于免疫組化分析和RNA測序分析的大型轉錄組和蛋白組數據庫,HPA數據庫中的蛋白質數據覆蓋了所有人類蛋白質編碼基因的86%，可對腫瘤和正常組織進行蛋白的差異表達分析[17]．本研究引用數據庫中NPTX2組化抗體(HPA049799、CAB020801)對正常腎組織和ccRCC組織進行免疫組化實驗，提取 3例正常腎組織和3例典型ccRCC組織，分析NPTX2蛋白的表達及抗體染色程度．

1.1.4 MethHC 數據庫

MethHC是一個關于腫瘤基因表達和DNA甲基化的綜合數據庫，整理了TCGA數據庫中腫瘤和正常組織的DNA甲基化和mRNA /miRNA表達譜[18]．本研究使用MethHC分析NPTX2在ccRCC組織中的甲基化水平，設置檢索條件如下：①Search by：gene；②Cancers：KIRC；③Gene region：Promoter；④Select a methylation lever evalution method：Average；⑤Gene search：NPTX2．

1.1.5 String-DB

String-DB是一個分析生物學基因或蛋白相互作用的數據庫，整合了已知和可預測的蛋白質-蛋白質相互作用的生物數據[19-20]．該數據庫可為本研究提供NPTX2與上下游蛋白的相互作用分析．設置檢索條件如下：①Protein Name：NPTX2；②Organism：Homo sapiens；③Minimum required interaction score：medium confidence(0.400)；④Max number of Interactors：no more than 20 interactors．

1.2 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計學分析采用SPSS 13.0軟件處理數據.分析NPTX2在正常腎組織和ccRCC組織中的表達差異情況時，用t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗進行非配對樣本的組間比較；用配對t檢驗進行配對樣本的組間比較；用one-way ANOVA分析NPTX2mRNA表達與ccRCC臨床病理分期間的關系；用Kaplan-Meier法對ccRCC患者進行生存分析；用Cox比例風險回歸模型分析NPTX2mRNA表達與ccRCC患者預后的關系.P<0.05為有統(tǒng)計學差異.

2 結果

2.1 NPTX2 mRNA在其他腫瘤組織和ccRCC組織中的表達

通過Oncomine數據庫分析NPTX2在20項腫瘤中的表達水平，與其他腫瘤組織相比，NPTX2mRNA在腎癌中表達增高(圖1)．按照前述條件，得出子數據庫Beroukhim Renal[21]、Jones Renal[22]、Gumz Renal[23]和Lenburg Ranal[24]的5項研究(圖2)．

圖1 Oncomine數據庫中NPTX2mRNA在所有腫瘤研究中的表達

Fig.1 The expression ofNPTX2mRNA in all oncological studies of Oncomine database

Beroukhim Renal數據庫中有70個樣本、12 624個被檢基因，在遺傳性ccRCC中，NPTX2在過表達基因中排第397位(前4%)，差異倍數=7.961，P=7.62×10-10；在非遺傳性ccRCC中，NPTX2在過表達基因中位于第127位(前2%)，差異倍數=23.543，P=7.53×10-11．Jones Renal數據庫中有92個樣本、12 624個被檢基因，NPTX2在過表達基因中位于第779位(前7%)，差異倍數=18.745，P=1.29×10-10．Gumz Renal數據庫中有20個樣本、12 624個被檢基因，NPTX2在過表達基因中排第424位(前4%)，差異倍數=54.781，P=2.00×10-6．Lenburg Ranal數據庫中有18個樣本、17 779個被檢基因，NPTX2在過表達基因中排第769位(前5%)，差異倍數=9.920，P=6.38×10-4．在5項研究中，NPTX2mRNA在ccRCC中的表達皆高于正常組織(表1)．而對5項研究結果薈萃分析得出，與正常組織組相比，NPTX2mRNA在ccRCC中高表達(P=2.00×10-6)．

A:Beroukhim Renal(遺傳性ccRCC);B:Beroukhim Renal(非遺傳性ccRCC);C:Jones Renal;D:Lenburg Renal;E:Gumz Renal.

研究項目ccRCC組織樣本量正常腎組織樣本量差異倍數PtBeroukhim Renal(遺傳性ccRCC)32117.9617.62E-107.931Beroukhim Renal(非遺傳性ccRCC)271123.5437.53E-119.541Jones Renal232318.7451.29E-1010.626Lenburg Ranal999.9206.38E-044.728Gumz Renal101054.7812.00E-068.617

使用GEPIA分析595個TCGA數據庫來源的樣本，其中正常腎組織72例，ccRCC組織523 例，可見與正常腎組織相比，NPTX2mRNA在ccRCC中高表達(P<0.05)，與Oncomine數據庫結果相符(圖3)．

2.2 NPTX2 mRNA表達與ccRCC臨床病理分期的關系

在GEPIA使用TCGA數據分析NPTX2mRNA表達與ccRCC臨床病理分期的關系，使用one-way ANOVA，以病理分期為變量計算差異表達，根據患者病理主要階段生成小提琴圖，結果顯示：NPTX2mRNA表達水平與ccRCC臨床病理分期呈正相關，高級別分期與低級別分期相比，NPTX2mRNA高表達核心密度帶寬更高，有統(tǒng)計學差異(P=2.61×10-3)(圖4)．

圖3 GEPIA數據庫中NPTX2 mRNA在ccRCC組織中的表達

Fig.3 Expression ofNPTX2mRNA in ccRCC tissues of GEPIA database

圖4 GEPIA數據庫中NPTX2mRNA表達與ccRCC病理分期的關系

Fig.4 Relationship betweenNPTX2mRNA expression and pathological stage of ccRCC in GEPIA database

2.3 NPTX2 mRNA表達與ccRCC患者預后的關系

通過GEPIA使用TCGA 數據分析NPTX2mRNA表達與ccRCC患者預后的關系，得出NPTX2mRNA高表達患者129例與低表達患者128例的總體生存率以及無病生存率曲線．結果顯示：NPTX2mRNA高表達患者其總體生存率明顯低于低表達患者(LogrankP=6.6×10-3，HR=1.8，P(HR)=7.2×10-3)(圖5)；此外，NPTX2mRNA高表達患者的無病生存率亦低于低表達患者(LogrankP=4×10-4，HR=2.6，P(HR)=6.6×10-4)(圖6)．NPTX2高表達可能是ccRCC患者生存率降低的風險因素．

圖5 GEPIA數據庫中NPTX2mRNA不同表達的ccRCC患者總體生存率

Fig.5 Overall survival rate of ccRCC patients with differentNPTX2mRNA expression of GEPIA database

圖6 GEPIA數據庫中NPTX2mRNA不同表達的ccRCC患者無病生存率

Fig.6 Disease free survival rate of ccRCC patients with differentNPTX2mRNA expression of GEPIA database

2.4 NPTX2蛋白在正常腎組織和ccRCC組織中的表達情況

在HPA數據庫中，采用NPTX2組化抗體(HPA049799、CAB020801)分析正常腎組織和ccRCC組織的免疫組化結果，在3例正常腎組織中腎小管細胞中抗體染色均為“低”水準，腎小球細胞中分布極少，未檢測出；在3例ccRCC患者腫瘤細胞中均呈“高”水準(圖7)．由此進一步證實NPTX2蛋白在ccRCC中較正常腎組織高表達．

圖7 NPTX2蛋白在ccRCC組織與正常腎組織中的表達(免疫組化染色)

2.5 ccRCC中NPTX2的DNA甲基化水平

在MethHC數據庫中得出NPTX2的甲基化轉錄模板NM_002523；在ccRCC與正常腎組織的甲基化水準差異分析中，其在ccRCC中的甲基化水平較正常組織高，有統(tǒng)計學差異(P<0.005)(圖8)；并且在ccRCC中NPTX2啟動子區(qū)甲基化水平較正常組織甲基化水平明顯升高(圖9)．

2.6 NPTX2與上下游蛋白的相互作用

使用String-DB分析NPTX2與上下游蛋白的相互作用，按照前述條件得出NPTX2蛋白交互作用網絡圖(圖10)，PPI富集P值 (protein-protein interaction enrichment p-value)=6.68×10-4，相互作用的節(jié)點數為21個，其中在 PPI網絡中與NPTX2相互作用(score>0.400)的有AVP、MT-ATP6、MT-ATP8、MT-ND4、NPAS4、CBLN1、BDNF、TYMP等，主要參與了氧化磷酸化、ATP代謝過程、細胞間信號傳導、調節(jié)神經沖動的傳遞、興奮性突觸后電位等生物過程．

圖8 正常腎組織和ccRCC組織NPTX2甲基化水平比較

Fig.8 Comparison of NPTX2 methylation level in normal kidney tissues and ccRCC tissues

圖9 正常腎組織和ccRCC組織NPTX2啟動子區(qū)甲基化水平比較

圖10 NPTX2蛋白交互作用網絡圖

3 討論

腎臟惡性腫瘤占所有腫瘤的3.8%，是常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢，在過去20年，全球發(fā)病率增加了2%．ccRCC是其中最常見的類型，男性與女性的發(fā)病比例為1.5∶1，60～70歲發(fā)病率最高．ccRCC的預后較其他RCC更差，28%的ccRCC患者在確診時已經是晚期疾病，主要采用外科手術治療，其他治療方案如化療和放療等的效果并不明顯，仍存在復發(fā)率高和預后差的問題[11-12]．現普遍依據2016版WHO/ISUP對ccRCC進行分級、治療指導及預后評估，但仍沒有適合常規(guī)使用的預測性分子生物標志物[25]．多項研究顯示ccRCC的相關分子標記物如CAIX，PTEN和CXCR4中沒有一個明顯改善了當前預后系統(tǒng)的預測準確性[12]，因此，進一步探索其生物學標志物和治療靶點等對ccRCC患者有重要的臨床意義．

1995年，Hsu等[1]在分離NPTX1的人同源物時，首次報道了NPTX2，長度為11 kb，包含了4個內含子，并定位于染色體7q21.3-q22.1．NPTX2是NPTX家族中的成員, 成員包括NPTX1、NPTX2和NPTXR．NPTX家族與CRP和SAP等急性反應蛋白同源，并且與興奮性突觸的形成和突觸發(fā)育過程相關[2]．NPTX2具有Ca2+依賴的凝集素結合活性，其特性有助于其黏附于細胞膜上，調節(jié)突觸前物質的攝取，在突觸形成和重塑過程中可以調節(jié)突觸中降解物質的攝取[26]．此外，NPTX2還可與NPTXR形成多聚體混合物，作用于細胞膜表面，與AMPA選擇性谷氨酸受體亞基結合，以促進興奮性突觸的形成和發(fā)育，或調節(jié)突觸前物質的攝取，是一種細胞外AMPA受體聚集因子[4]．Ishiuchi等[27-28]的研究中提到，由AMPA介導的Ca2+信號通過激活受體Akt可以調節(jié)神經膠質母細胞瘤細胞的增殖和遷移．Ca2+滲透性AMPA受體的激活在神經膠質母細胞瘤的生長中有重要作用．在ccRCC中NPTX2的作用可能亦與此相關．

Von Roemeling等[13]的研究發(fā)現NPTX2的活性介導了ccRCC腫瘤細胞的存活和侵襲，機制與AMPA選擇性谷氨酸受體4(GluR4)有關，在正常的生理環(huán)境中，GluR4的表達主要定位于中樞神經系統(tǒng)中特定的神經元和神經膠質細胞，介導快速突觸神經傳遞，NPTX2在GluR4的突觸募集中發(fā)揮重要作用[26]．NPTX2可與ccRCC細胞膜上的GluR4相連形成復合物AMPAR, AMPAR通過介導增加細胞內Ca2+的流入，導致肌動蛋白細胞骨架的重組，并促進細胞的增殖與遷移．Von Roemeling等[13]還發(fā)現可以通過使用變構AMPA受體拮抗劑CFM-2來減少NPTX2的過表達，從而抑制ccRCC腫瘤細胞的增殖．由此可見，抑制NPTX2與GluR4結合形成AMPAR，可能對轉移性ccRCC有一定意義，NPTX2有望成為ccRCC的診斷標志物以及治療靶點．

本研究分別分析了Oncomine數據庫中Beroukhim Renal等4個子數據庫的5項研究，并進行薈萃分析，得出與正常組織組相比，NPTX2mRNA在ccRCC中存在顯著高表達．并以GEPIA對TCGA數據進行分析，驗證結果與 Oncomine 數據庫一致，即NPTX2mRNA在ccRCC中高表達．

目前普遍采用世界衛(wèi)生組織(WHO)與國際泌尿外科病理學會(ISUP)于2012年提出的ccRCC病理分期系統(tǒng)作為ccRCC的預后指標，該系統(tǒng)基于腫瘤的核仁評估分期：G1期：400倍光鏡下腫瘤細胞無核仁或核仁不明顯；G2期：400倍光鏡下腫瘤細胞可見清晰核仁，但在100倍光鏡下核仁不明顯或不清晰；G3期：100倍光鏡下可見清晰的核仁；G4期：可見明顯多形性的核仁、腫瘤巨細胞和/或肉瘤樣形態(tài)或橫紋肌樣分化[29-30]．在GEPIA的分析結果中得出，高級別分期與低級別分期相比，NPTX2mRNA高表達核心密度帶寬更高，即NPTX2mRNA表達水平與ccRCC臨床病理分期呈正相關．

此外，NPTX2高表達的ccRCC患者總體生存率以及無病生存率皆明顯低于低表達患者，NPTX2的高表達可能是ccRCC患者生存率降低的風險因素．而HPA數據庫的免疫組化分析結果亦證實，NPTX2蛋白在ccRCC中也較正常腎組織高表達，并且在MethHC數據庫進行的甲基化水準差異分析得出，ccRCC中NPTX2啟動子區(qū)甲基化水平明顯增高．

使用String-DB分析發(fā)現，NPTX2與AVP、MT-ATP6、MT-ATP8、MT-ND4、NPAS4、CBLN1、BDNF、TYMP等蛋白存在相互作用，主要參與氧化磷酸化、ATP代謝過程、細胞間信號傳導、調節(jié)神經沖動的傳遞、興奮性突觸后電位等生物過程．其中，NPTX2與MT-ATP6、MT-ATP8、MT-ND4協同參與了氧化磷酸化(GO：0006119)、ATP代謝過程(GO：0046034)．通過呼吸鏈的操作，伴隨代謝物氧化的ADP磷酸化為ATP．氧化化合物會在細胞膜上建立質子梯度，從而為ATP合成提供能量.另外，NPTX2與AVP、CBLN1、BDNF、NPAS4等蛋白協同參與了細胞間信號傳導(GO：0007267)，過程包括接收細胞中的轉導信號、一定條件下配體的釋放，以及促進其轉運和呈遞至接收細胞的過程．例如通過可溶性配體，通過細胞粘附分子和通過間隙連接的信號傳導等．而NPTX2與AVP、TYMP可協同參與調節(jié)神經沖動的傳遞(GO：0051969)，通過調節(jié)神經沖動的頻率、速率或程度，響應在神經元膜上刺激傳播的順序及電化學極化和去極化的過程．NPTX2與NPAS4、GRIA2、GRIA4協同參與興奮性突觸后電位(GO：0060079)，即帶正電離子流入突觸后細胞而導致突觸后電位暫時增加的過程，通過引發(fā)興奮性突觸后電位的離子流，引發(fā)興奮性突觸后電流，可使神經元更容易激發(fā)動作電位．

綜上所述，本研究結果顯示NPTX2在ccRCC組織中呈高表達，且其表達與患者預后相關．將有可能成為ccRCC的診斷標志物以及治療靶點，有必要對NPTX2與ccRCC的治療靶點及轉移風險的預測進行更深入的探究，本研究為后續(xù)的研究提供了線索和理論依據．本研究不足之處，NPTX2與ccRCC的相關分析是從各個公開資料庫進行數據挖掘綜合分析而得出，其數據樣本來源大多非中國人，實為一種探索型研究，需要更多實驗研究以及我國臨床樣本加以驗證．