金海如，蔣湘艷，夏婷婷

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004）

叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizal，簡稱AM）真菌是一類可以與植物根系很好形成共生關(guān)系，且分布最為廣泛、數(shù)量最多的內(nèi)生菌根真菌［1］，其菌絲包括根內(nèi)菌絲（Intraradical Mycelium，IRM）和根外菌絲（Extraradical Mycelium，ERM），ERM可以深入土壤中，擴(kuò)大根系吸收面積，進(jìn)而促進(jìn)寄主植物對水分及礦質(zhì)元素氮、磷、鉀、硫等的吸收［2］。共生體的存在會增加植物生物量，提高光合作用［3］。AM 真菌促進(jìn)宿主植物生長的同時，也依賴植物通過光合作用產(chǎn)生的碳水化合物傳遞給AM 真菌作為其碳源［4］。研究表明植物缺氮導(dǎo)致葉細(xì)胞偏小，水分傳導(dǎo)率降低。缺磷引起根細(xì)胞壁彈性減少、抑制葉的生長。氮、硫等養(yǎng)分缺乏直接影響葉綠素和蛋白質(zhì)的合成［5］。關(guān)于AM 真菌吸收土壤中氮磷的分子基礎(chǔ)和基因調(diào)控方面已取得了重要成果，Jin 等［6-7］證明菌根真菌吸收氮源以精氨酸（Arg）的形式從ERM 轉(zhuǎn)運(yùn)到IRM。IRM 內(nèi)Arg 通過尿素循環(huán)分解為尿素和鳥氨酸（Orn）。尿素通過脲酶（urease）分解為NH3和CO2，Orn 則由相關(guān)酶的作用進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為谷氨酸再利用。而磷進(jìn)入到真菌胞質(zhì)，以多聚磷酸鹽（PolyP）的形式從ERM 運(yùn)輸?shù)絀RM，被質(zhì)膜上的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Pi-transport protein）轉(zhuǎn)運(yùn) 到 植 物 體 內(nèi)［8］。PloyP 在IRM 中 裂 解 的 同 時釋放Arg，促進(jìn)Arg 裂解成氨隨后轉(zhuǎn)運(yùn)到菌根界面［9-10］，說明菌根內(nèi)氮和磷的運(yùn)輸是相關(guān)聯(lián)的。

目前我國過量施用化肥已到極限，以氮肥為例，我國氮肥平均使用量是近美國的3 倍、澳大利亞的8 倍多［11］。這造成一系列的資源、生態(tài)和環(huán)境問題，化肥與農(nóng)藥的濫用使得水資源和土壤污染嚴(yán)重［12］。所以將菌根作為一種“生物菌肥”將對農(nóng)業(yè)的增產(chǎn)有很大的幫助，其為發(fā)展綠色有機(jī)農(nóng)業(yè)起到關(guān)鍵性的作用［13-14］。

目前，有關(guān)如何有效提高玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的研究很多。朱紅英［15］研究了控釋肥料對玉米的影響效應(yīng)。黎陽燕［16］研究了豬糞和化肥配施對玉米影響。Smith 等［17］關(guān)于AM 真菌對玉米等作物生長的作用進(jìn)行了概述。Baum 等［18］介紹了AM 真菌生物肥料提高蔬菜作物產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量。盡管關(guān)于AM真菌分解有機(jī)質(zhì)并吸收釋放氮，進(jìn)而輸運(yùn)給寄主植物吸收利用的研究已經(jīng)很多報道［19-22］，這些都是在人工設(shè)計的基質(zhì)及在實(shí)驗(yàn)室完成得出的結(jié)論。當(dāng)前關(guān)于泥炭、泥灰和有機(jī)肥等有機(jī)物料對田間種植的菌根化甜玉米生長和品質(zhì)的實(shí)際影響還不清楚。泥炭、泥灰和有機(jī)肥中含有植物生長所必需的礦質(zhì)元素，如氮和磷元素等。本文以甜玉米為寄主植物，以AM 真菌為接種菌劑，以泥炭、泥灰和牛糞有機(jī)肥為有機(jī)物料，在接菌條件下，研究不同有機(jī)物料對玉米籽粒氮磷含量、菌根精氨酸含量、籽粒淀粉及可溶性糖含量、蛋白質(zhì)組分及氨基酸組分等的影響，從而探究不同有機(jī)物料對菌根化玉米生長及品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及其處理

以金華玉米（東糯4 號）為宿主材料，選取500 粒顆粒飽滿的玉米種子，用10%的H2O2浸泡10min 左右，然后用去離子水漂洗干凈，再浸泡5h，分別播種于121℃經(jīng)2h 滅菌的沙子和草木灰混合的培養(yǎng)基質(zhì)中，其中不加添加劑為空白對照。沙子中添加劑的量，由其中含有的磷元素的量決定，保證草木灰混合基質(zhì)中磷的含量為10mg/kg。分別接種AM 真菌菌劑1mL（孢子含量約為200個），不加菌的為對照組（CK）。每個處理設(shè)置15 個重復(fù)，共4×15×2=120 盤，每個培養(yǎng)杯有32 盤，共需4 個培養(yǎng)杯。將處理好的培養(yǎng)杯放于智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20d 左右，期間施加一次限氮限磷的Hoagland 營養(yǎng)液。玉米菌根侵染率達(dá)到60%時，移栽至試驗(yàn)田中。同時添加的有機(jī)物料為泥灰（磷含量：20mg/kg）、泥炭（磷含量：200mg/kg）、有機(jī)肥（磷含量：1000mg/kg），每株處理加有機(jī)物料250g，期間15d 施加一次限氮限磷的Hoagland 營養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)

育苗期：在生化智能培養(yǎng)箱，光照12h，無光照12h。生長期：金華湯溪鎮(zhèn)寺平稻米合作社試驗(yàn)田。生長60d 后收獲，進(jìn)行各項指標(biāo)的測定。

1.3 測定方法

1.3.1 樣品重量測定

將甜玉米分為地上部植株和穗，另外收集菌絲室ERM。將菌根室的根系和菌絲室的ERM 洗凈后用紙吸干，用電子天平分別稱量植株和穗重及ERM 鮮重。幼苗株高采用刻度尺測量。

1.3.2 根系侵染率測定

采用曲利苯藍(lán)染色-方格交叉法［23］測定菌根侵染率。具體步驟為：（1）根樣采集：從不同處理組的甜玉米根系不同位置選取較細(xì)的根并剪成1cm左右長的根段，將剪好的根段放置試管底部，備用。（2）透明：向放置根段的試管中加入10%的KOH，將根段浸沒即可。再將試管90℃水浴加熱2h。（3）清洗：將處理后的KOH 倒出，并用自來水反復(fù)清洗試管中根段，直到漂洗的水不再呈黃色為止。（4）軟化：向放置清洗過的根段的試管中加入軟化劑（10%H2O2），浸沒根段。室溫條件下放置1h。（5）酸化：重復(fù)步驟3 清洗步驟。接著向放置根段的試管中加入酸化劑（1%HCl 溶液）酸化10min。（6）染色：重復(fù)步驟3 清洗步驟。向放置根段的試管中加入染色劑，并浸沒根段。于90℃水浴中染色1h。（7）脫色：將染色好的根段染色劑倒掉，用自來水清洗數(shù)次。接著向處理好的根段中加入脫色劑（乳酚），脫色30min，倒掉脫色劑，用自來水清洗數(shù)次。再重復(fù)步驟7 一次。（8）鏡檢：從不同處理組中已染色的根系中分別挑取40 根根段于培養(yǎng)皿中進(jìn)行鏡檢測定，并計算出甜玉米菌根侵染率。

1.3.3 總氮、總磷和精氨酸含量測定

將甜玉米籽粒冷凍干燥處理后，籽?？偟坎捎脛P氏定氮法［24］；總磷含量采用鉬銻抗顯色法［25］。菌根精氨酸含量參照郝剛等［26］實(shí)驗(yàn)方法，用甲萘酚-雙乙酰法測定。

1.3.4 蛋白質(zhì)組分提取和分析

蛋白質(zhì)組分分離用逐步提取法［27］。（1）總蛋白提?。悍謩e稱取不同處理的玉米粉1g 放入研缽中，加5mL 蒸餾水，將籽粒研磨成勻漿，將勻漿倒入錐形瓶中，再分別向錐形瓶中加入0.4%NaOH 溶液20mL。放入65℃水浴鍋中提取5h。冷卻至室溫，11000r/min 離心20min。取上清液，即為總蛋白提取液。（2）清蛋白提?。喝∮衩追?g，置于研缽中，加15mL 蒸餾水，研磨至勻漿。將研磨好的材料轉(zhuǎn)移至離心管中。11000r/min 離心20min。將提取液用蒸餾水定容至50mL。即為清蛋白提取液。（3）球蛋白提取：向（2）中離心管的殘渣中加入10mL 的10%NaCl 溶液，用玻璃棒攪勻，同上離心。將提取液用10%NaCl 定容至50mL，得到球蛋白提取液。（4）醇溶蛋白提?。合颍?）中鹽溶液提取后的殘渣中加入10mL 的75%乙醇溶液。用玻璃棒攪拌，將混合液放在80℃熱水中加熱5min。同上離心，取上清液至燒杯中，向離心管中再加入75%乙醇（重復(fù)3 次）。將提取液用75%的乙醇溶液定容至50mL。即為醇溶性蛋白提取液。（5）谷蛋白的分離：向（3）中醇提取的殘渣中，加入0.2%的NaOH 溶液10mL，用玻璃棒攪拌15min，離心，取上清液于燒杯中（重復(fù)3 次）。將提取液用0.2%的NaOH 溶液定容至50mL，即為谷蛋白提取液。測蛋白含量所需染液：考馬斯亮藍(lán)G250（0.01%），蛋白質(zhì)含量測定采用凱式定氮法。

1.3.5 可溶性糖和單糖組分含量測定

可溶性糖提取步驟：稱取玉米粉0.5g，放入研缽中，加入5mL 蒸餾水磨成勻漿，轉(zhuǎn)入錐形瓶中，再用10mL 的蒸餾水沖洗研缽3 次，洗出液也轉(zhuǎn)入錐形瓶中。處理好的樣品在沸水浴中提取1h，冷卻后過濾并定容至100mL，即為待測液?？扇苄蕴呛繙y定采用蒽酮比色法［28］。單糖組成分析采用薄層色譜法［29］。

1.3.6 氨基酸組分測定

氨基酸組分測定采用氨基酸自動分析儀法［科標(biāo)技術(shù)（青島）研發(fā)中心］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行方差分析和樣本平均數(shù)的顯著性分析。采用Orign8.0 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同有機(jī)物料對菌根化玉米的生物量及菌根侵染率的影響

由表1 可知：大田試驗(yàn)中，施加不同有機(jī)物料條件下，接種AM真菌較不接種AM 真菌時玉米生物量顯著提高，菌根化甜玉米較正常玉米幼苗期的株高高出17.5%，穗重和株重提高了6.4%和5.28%。接菌條件下，施加有機(jī)物料泥炭或泥灰時，幼苗株高顯著提高，分別為40.50 和39.92cm，比正常玉米幼苗期的株高高出25.01%和23.21%，穗重和株重提高13.13%和11.41%；而施加有機(jī)肥時，幼苗株高比空白組顯著降低，甚至有抑制生長現(xiàn)象。接菌條件下，施加有機(jī)肥時穗重和株重最高，分別為301.16 和334.50g，比空白組提高了49.53%和67.83%，且菌根侵染率提高27.7%。

表1 有機(jī)物料對菌根化玉米生物量及菌根侵染率的影響

2.2 不同有機(jī)物料對菌根化玉米籽粒氮磷含量及菌根精氨酸含量的影響

如圖1 所示，接種AM 真菌玉米籽粒中總氮含量總體比不接種菌時顯著提高。在接種菌劑條件下，施加泥炭時籽粒中總氮含量最高，泥灰次之，比空白組籽粒中總氮含量高17.6%。菌根化甜玉米籽?？偭缀勘日Ｓ衩滋岣吡?0.2%，施加有機(jī)肥時，菌根化玉米籽?？偭缀刻岣?5.1%。施加其他有機(jī)物料時效果不明顯。

施加不同有機(jī)物料時，AM 真菌吸收的氮營養(yǎng)不同，從而AM 真菌組織中產(chǎn)生的Arg 也有所差異。接菌后，施加泥炭和泥灰，玉米根部Arg 含量最多，分別為3.38 和2.97mg/g，有機(jī)肥次之，空白組含量最少，且差異顯著。

2.3 不同有機(jī)物料對菌根化玉米籽粒淀粉和可溶性糖含量的影響

圖1 不同有機(jī)物料對菌根化玉米籽粒氮、磷及菌根精氨酸含量的影響

圖2 不同有機(jī)物料對菌根化玉米籽粒淀粉和可溶性糖含量的影響

如圖2 所示，施加不同有機(jī)物料時，接種AM真菌均提高了玉米籽?？扇苄蕴呛偷矸酆俊＞衩鬃蚜Ｖ械矸酆涂扇苄蕴呛恳蛴袡C(jī)物料種類不同而異。淀粉含量為：泥灰＞泥炭＞有機(jī)肥＞空白?？扇苄蕴呛恳渤蚀粟厔?，且施加泥灰的玉米籽粒中糖含量為90.3mg/g，比空白組增加近一倍。此外，對籽粒中的多糖進(jìn)行水解，利用薄層層析快速分析其中單糖種類及含量。由圖2 可得，展開系統(tǒng)中分離出標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖，所對應(yīng)的斑點(diǎn)的Rf 值為0.12。分析不同處理組水解所得單糖斑點(diǎn)位置與標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖位置基本相同，Rf 值在0.12 左右。初步判斷不同處理組水解得到單糖主要為葡萄糖。顯色后發(fā)現(xiàn)菌根化玉米籽粒中施加泥灰和泥炭時葡萄糖斑點(diǎn)較深，說明這兩個處理中葡萄糖含量最高。此結(jié)果與不同處理組籽粒中淀粉和可溶性糖含量相對應(yīng)。

2.4 不同有機(jī)物料對菌根化玉米籽粒蛋白質(zhì)及其組分含量的影響

由表2 可知，AM 真菌菌根化玉米與正常玉米相比籽粒中的總蛋白增加12.25%，而施加泥炭和泥灰時，玉米籽粒中的總蛋白顯著高于對照組約20.1%，所以AM 菌根化和施加有機(jī)物料可以協(xié)同提高其氮素營養(yǎng)。接菌情況下，蛋白質(zhì)總量因有機(jī)物料不同而存在差異。施加泥炭時，總蛋白含量最高，為10.68%；泥灰次之，為10.21%；有機(jī)肥為8.86%。施加不同有機(jī)物料兩種結(jié)構(gòu)蛋白含量沒有顯著差異，且均低于貯藏蛋白含量。醇蛋白和谷蛋白含量因添加物料的不同具有顯著差異。施加泥炭和泥灰時，醇溶蛋白和谷蛋白含量相對較高。

表2 籽粒蛋白質(zhì)及其組分含量（%）

2.5 施加泥炭條件下菌根化玉米籽粒氨基酸組分分析

由表2可知，施加泥炭時菌根化玉米籽粒蛋白質(zhì)含量相對較高，于是對其中水解氨基酸含量進(jìn)行分析并與空白組進(jìn)行對照。從表3 可看出玉米籽粒中含有16 種水解氨基酸成分。其中包括8 種人體必需氨基酸，即蛋氨酸、纈氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸、組氨酸。施加泥炭時菌根化玉米籽粒每種氨基酸組分均大于空白組，總氨基酸含量提高14.98%。

3 小結(jié)與討論

AM 真菌作為微生物肥料，可廣泛應(yīng)用于小麥、玉米、水稻、高粱等［30］，施加后有利于植株根系吸收有機(jī)物中礦質(zhì)元素氮和磷［7，31-33］，明顯改善植株的營養(yǎng)代謝。而泥炭、泥灰和牛糞有機(jī)肥中富含植物生長所需的氮（分別為1.8%、0.05%、1.0%）和磷（分別為0.15%、0.55%、0.5%）等礦質(zhì)元素。本研究發(fā)現(xiàn)菌根化甜玉米比正常玉米幼苗期的株高高出17.5%，穗重和株重提高了6.4%和5.28%。在施加泥炭、泥灰和有機(jī)肥以后，比單純的菌根化甜玉米幼苗期的株高高出8%，穗重和株重提高近一倍，尤其是有機(jī)肥更加顯著。施加有機(jī)肥時幼苗生長緩慢甚至有燒苗現(xiàn)象，可能是由于有機(jī)肥漚肥時間過短，但在植株生長后期有促進(jìn)作用。這說明了菌根化和施加有機(jī)物料可以協(xié)同提高甜玉米產(chǎn)量，與近來Thirkell 等［34］發(fā)現(xiàn)了AM 真菌可以分解田間的有機(jī)質(zhì)并且促進(jìn)了寄主植物對氮素等營養(yǎng)的吸收及其產(chǎn)量的提高的結(jié)論一致。

表3 玉米籽粒中水解氨基酸組分及其含量（%）

施加AM 真菌和有機(jī)物料可以協(xié)同提高甜玉米的營養(yǎng)品質(zhì)。菌根化甜玉米籽?？偭缀勘日Ｓ衩滋岣吡?0%，施加有機(jī)肥時，菌根化玉米籽?？偭缀刻岣?5.1%。施加其他有機(jī)物料時效果不明顯，甚至比空白組含磷量更低。說明有機(jī)肥中可能含有較豐富磷元素供玉米植株生長。Willmann 等［35］的研究也發(fā)現(xiàn)了在菌根化玉米中低磷條件下主要是磷運(yùn)輸?shù)鞍譖ht1;6 對磷的吸收貢獻(xiàn)最大，這個蛋白基因也負(fù)責(zé)控制玉米生物量的增加和穗的產(chǎn)量。接種AM 真菌玉米籽粒中總氮含量比不接菌時顯著提高。在接種菌劑條件下，施加泥炭時總氮含量最高，泥灰次之，空白組籽粒中總氮含量最低。這是因?yàn)橛袡C(jī)物料如泥炭和泥灰中含有氮元素，泥炭含有氮1.8%，泥灰只含有少量氮素，可以為植株提供營養(yǎng)。AM 真菌吸收土壤中外源氮傳遞到植物過程中，Arg 是氮素營養(yǎng)由根外菌絲傳遞到根內(nèi)菌絲再傳遞給植物供其吸收的氮素載體［7，33］。菌根Arg的含量反映了氮素的吸收效率。該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)施加泥炭和泥灰時菌根Arg 含量較高，進(jìn)一步表明Arg 的積累與玉米氮素吸收有直接相關(guān)性。說明AM 真菌與植株共生時，可以幫助玉米植株根系吸收土壤中氮素養(yǎng)分。

此外，AM 真菌菌根化玉米與正常玉米相比籽粒中的總蛋白增加12.25%，而施加泥炭和泥灰時，玉米籽粒中的總蛋白顯著高于對照組約20.1%，所以AM 菌根化和施加有機(jī)物料可以協(xié)同提高其氮素營養(yǎng)。蛋白質(zhì)的組分是評價籽粒品質(zhì)的一個重要指標(biāo)。根據(jù)蛋白質(zhì)在溶劑中的溶解特性可將籽粒中的蛋白質(zhì)分為4 種類型，包括屬于結(jié)構(gòu)蛋白的清蛋白和球蛋白及屬于貯藏性蛋白的醇溶蛋白、谷蛋白［27］。研究表明菌根化玉米籽粒中不同處理組的貯藏蛋白的含量均高于結(jié)構(gòu)蛋白，這與張海艷等［36］的研究即醇溶蛋白等儲存蛋白對總蛋白含量影響最大的結(jié)論一致。此現(xiàn)象與Stone 等［37］的研究，即清蛋白和球蛋白作為結(jié)構(gòu)蛋白在籽粒生長早期迅速積累，隨著籽粒胚乳物質(zhì)灌漿充實(shí)而逐漸減少，醇溶蛋白和谷蛋白作為貯藏蛋白在籽粒生長后期積累較快的結(jié)果相符合。氨基酸是蛋白質(zhì)合成的基本單位，本文對蛋白質(zhì)含量相對較高的泥炭組處理的菌根化玉米籽粒進(jìn)行氨基酸組分分析，檢測出16 種水解氨基酸且含量均高于空白組，其中包括8種人體必需氨基酸。邵金良等［38］研究得出玉米籽粒水解氨基酸中谷氨酸、亮氨酸含量較高。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。所以施加泥炭時能提高玉米籽粒中氨基酸的含量，特別是8 種必需氨基酸，從而大大改善玉米營養(yǎng)。菌根化甜玉米與正常玉米相比，在淀粉和可溶性糖含量上提高不明顯，但是施加有機(jī)物料特別是泥灰后可溶性糖增加近一倍。

綜上所述，有機(jī)物料和AM 真菌對寄主植物甜玉米產(chǎn)量及營養(yǎng)具有協(xié)同作用。驗(yàn)證了國外專家［19-22］研究發(fā)現(xiàn)AM 真菌可以分解土壤中的有機(jī)質(zhì)并且吸收大量的氮素的結(jié)論。此外，Cheng 等［39］發(fā)現(xiàn)提高CO2促進(jìn)土壤有機(jī)碳的分解，其中的機(jī)理是土壤有機(jī)質(zhì)分解產(chǎn)生可以利用的NH4+，由AM 真菌吸收后轉(zhuǎn)遞給寄主植物的根部進(jìn)而促進(jìn)氮的吸收和植物生長，解釋了AM 真菌和有機(jī)質(zhì)對寄主植物氮素吸收及生長的協(xié)同作用。本研究通過在田間試驗(yàn)進(jìn)一步確證了對菌根化玉米施加有機(jī)物料，有利于增加玉米籽粒中磷素和氮素含量，提高了可溶性糖、淀粉、蛋白質(zhì)和氨基酸含量等產(chǎn)品的品質(zhì)。