陳鵑 王正兵（通訊作者） 高振山 高長(zhǎng)春 孟敏 孫樹松

（南京市六合區(qū)人民醫(yī)院普外科 江蘇 南京 211500）

結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移是晚期結(jié)腸結(jié)直腸癌最常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之一，相關(guān)調(diào)查研究[1]發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者就診時(shí)肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率就可達(dá)15%-25%。K-ras基因作為RAS家族成員之一，被認(rèn)為是腫瘤啟動(dòng)基因之一，與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)。本研究通過(guò)分析結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移K-ras基因突變特點(diǎn)及其與臨床病理特征的相關(guān)性，旨在進(jìn)一步說(shuō)明結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移基因表達(dá)特點(diǎn)，因?yàn)轭A(yù)后評(píng)估提供可靠參考依據(jù)。

1.資料和方法

1.1 臨床資料

收集2017年12月－2019年11月在我院治療的103例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者，入選和排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移；②既往無(wú)抗腫瘤治療史；③臨床資料完整；④知情同意書，自愿參與實(shí)驗(yàn)；⑤排除合并其他轉(zhuǎn)移、心腦血管、血液疾病等其他疾病者；本研究過(guò)程經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。入選患者均接受結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移外科手術(shù)治療。

1.2 研究方法

1.2.1 獲取病理組織 在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移外科手術(shù)過(guò)程中，留取原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移灶處組織，經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋后切5μm片。

1.2.2 提取樣本組織DNA 選擇癌組織超過(guò)60%的蠟塊，常規(guī)脫蠟，用蛋白酶K、SDS溶液孵育24h，離心留取石蠟下液體，依據(jù)QIAamp DNA FFPF Kit試劑盒說(shuō)明書提取組織DNA，洗脫DNA后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA產(chǎn)物中DNA濃度，調(diào)至100μg/ml后置于-20℃保存。

1.2.3 PCR反應(yīng)及SSCP分析 參照文獻(xiàn)[2]制備PCR反應(yīng)體系，提取PCR反應(yīng)產(chǎn)物放于瓊脂糖凝膠電泳45min(70V)后，用EB溶液浸泡洗脫，將凝膠板放到紫外投射儀的玻璃板上，加入變性劑上樣緩沖液95℃下反應(yīng)10min,，置冰盒中10min后，加聚丙烯酰胺凝膠，電泳5min(250V)后,4℃冰箱電泳3h(3W)后，銀染凝膠，DNA清晰顯示后,終止反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移K-ras基因表達(dá)特點(diǎn)

本研究中K-ras基因突變患者共53例，突變率為51.46%，K-ras基因突變均是單堿基點(diǎn)突變，突變位置為12號(hào)密碼子(28例)和13密碼(25例)，突變類型為GGT→GAT突變(18例)、GGT→GTT突變(15例)、GGC→GAC突變(20例)。

2.2 K-ras基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，直腸癌肝轉(zhuǎn)移K-ras基因突變與K-ras基因未突變比，年齡、腫瘤分化程度、CA19-9表達(dá)，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；而性別、原發(fā)腫瘤部位、轉(zhuǎn)移灶大小、腫瘤分期、組織分型，P＞0.05，差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表。

表 K-ras基因突變與臨床病理特征差異性分析

3.討論

肝臟作為結(jié)直腸癌最主要的血行轉(zhuǎn)移靶器官之一，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移能夠增加結(jié)直腸癌死亡風(fēng)險(xiǎn)。隨著基因技術(shù)不斷的發(fā)展。臨床對(duì)于惡性腫瘤基因表達(dá)譜研究不斷深入。目前臨床已經(jīng)證實(shí)多種癌基因參與了結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程。K-ras基因是臨床公認(rèn)的癌變啟動(dòng)因子之一，能夠參與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程。K-ras基因突變時(shí)，p21蛋白結(jié)構(gòu)變異，與結(jié)合GTP能力下降，GTP酶活性受到抑制，信息轉(zhuǎn)導(dǎo)作用喪失，細(xì)胞進(jìn)入無(wú)節(jié)制分裂、增殖狀態(tài)，進(jìn)而出現(xiàn)細(xì)胞癌變和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者K-ras基因突變率超過(guò)50%，且K-ras基因突變狀態(tài)與年齡、腫瘤分化程度、CA19-9表達(dá)密切相關(guān)。鑒于目前K-ras基因突變和臨床病理特征關(guān)系仍存在爭(zhēng)議[3]，本研究樣本較小，仍需進(jìn)行大樣本研究加以證實(shí)。綜上所述，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者多存在K-ras基因突變，K-ras基因突變可能與年齡、腫瘤分化程度、CA19-9表達(dá)有關(guān)，建議臨床進(jìn)一步深入研究。