曹中贊，王曉娜，李 靜，陳美月 ，許建文 ，欒新紅

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110161；2.遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)管理站，沈陽 110032）

在現(xiàn)代肉牛的集約化養(yǎng)殖過程中，引種、售賣、異地屠宰和繁育等需要肉牛的流轉(zhuǎn)運(yùn)輸。而由于冷、熱、風(fēng)、雨、顛簸、擁擠、噪音、驚嚇、饑渴、體力耗費(fèi)、環(huán)境變化及潛在疾病等應(yīng)激因素的影響，肉牛會(huì)在運(yùn)輸過程中出現(xiàn)較為常見的應(yīng)激癥狀，表現(xiàn)為失重、致殘或致死、肉品質(zhì)和免疫力降低等，可見，運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)肉牛生產(chǎn)會(huì)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。研究認(rèn)為，機(jī)體在遭受應(yīng)激源刺激時(shí)，比如缺血[1]、缺氧[2]、中毒[3]、能量損失[4]，以及紅外線輻射[5]、磁場[6]，甚至心理方面的影響[7]等，都會(huì)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，并可能誘導(dǎo)產(chǎn)生一些具有不同生理功能的應(yīng)激蛋白（stress protein），其中研究最多的是熱應(yīng)激蛋白（heat shock protein，HSP）[8]。熱應(yīng)激蛋白對(duì)細(xì)胞的生存能力和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義[9-11]。之前很多研究人員通過給予豬只不同刺激來探究HSPs的表達(dá)及其變化，但在不同肌肉組織中并未發(fā)現(xiàn)HSPs表達(dá)的變化[12-15]，有關(guān)動(dòng)物運(yùn)輸后肌肉組織HSPs表達(dá)的研究報(bào)道更少[12-13,16]。本研究以遼育白牛為研究對(duì)象，飼喂兩種抗應(yīng)激添加劑后進(jìn)行運(yùn)輸，探討運(yùn)輸過程對(duì)肉牛機(jī)體應(yīng)激蛋白表達(dá)的影響，以及兩種抗應(yīng)激添加劑對(duì)肉牛運(yùn)輸應(yīng)激是否有改善作用，以期為兩種抗應(yīng)激添加劑在肉牛生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇體重和體況相近的健康出欄育肥遼育白牛27頭，隨機(jī)分成3組：對(duì)照組、抗應(yīng)激1號(hào)組和抗應(yīng)激2號(hào)組，每組9個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭牛，其中對(duì)照組飼喂常規(guī)基礎(chǔ)飼糧，抗應(yīng)激1號(hào)組飼喂添加劑1號(hào)，抗應(yīng)激2號(hào)組飼喂添加劑2號(hào)，每天1次，飼喂10d，在20℃、相對(duì)濕度51%的環(huán)境條件下，以50～60km·h-1的速度在公路上運(yùn)輸5h，其他內(nèi)容同王曉娜等[17]的報(bào)道。

1.1.2 主要試劑及器械 HSP70酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 （南京建成生物工程研究所）、HSP90抗體和HSP70抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）及辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（巴基斯坦SANTA公司）、Prime Script RT Reagent Kit試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白提取試劑盒、麗春紅染色液及ECL化學(xué)發(fā)光染料（北京普利萊公司）等。酶標(biāo)儀（TECAN公司）、凝膠成像系統(tǒng)（以色列DNR Micro Chemi 4.2）、PCR擴(kuò)增儀（S1000）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（iQ5）（美國Bio-Rad公司）等。

1.1.3 樣品采集 分別于運(yùn)輸前和運(yùn)輸后采集肉牛血液，制備血清，置于-20℃冰箱待測。運(yùn)輸后進(jìn)行屠宰，采集肉牛肌肉組織，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 肉牛血清中HSP70含量的檢測 采用ELISA法檢測肉牛血清中HSP70的含量，具體操作根據(jù)HSP70酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書。

1.2.2 肉牛運(yùn)輸后肌肉組織內(nèi)HSP27、HSP70和HSP90 mRNA表達(dá)量的檢測

1.2.2.1 組織樣本總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 從每組肉牛肌肉組織樣品中分別隨機(jī)選出3個(gè)，利用Trizol法進(jìn)行總RNA的提取，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作方法參見Prime Script RT Reagent Kit試劑盒說明書，所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA用于后續(xù)反應(yīng)。

1.2.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中已有的牛的看家基因GAPDH（Genbank:XR_083674.4）及目的基因HSP27（Genbank:BT021550.1）、HSP70（Genbank:BT030673.1）和 HSP90（Genbank:NM_001012670.2）的序列信息，采用Primer6.0設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成，引物序列見表1。

1.2.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按20μL反應(yīng)體系進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng) （具體操作參照試劑盒說明書）：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，上、下游引物各 0.8μL，cDNA 2μL，ddH2O 6.4μL。 一個(gè)組織樣品設(shè)定 3 個(gè)平行，并同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（在陰性對(duì)照孔內(nèi)加入2μL ddH2O），利用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，其公式為：

表1 肉牛內(nèi)參基因及目的基因的引物序列Table 1 Primer sequence of reference gene and target gene in beef cattle

1.2.3 肉牛運(yùn)輸后肌肉組織內(nèi)HSP70和HSP90蛋白表達(dá)水平的檢測

1.2.3.1 組織樣本總蛋白的提取 按照試劑盒說明書提取運(yùn)輸后肉牛肌肉組織的總蛋白，并使用BCA試劑盒檢測總蛋白量。

1.2.3.2 HSP70和HSP90蛋白表達(dá)量的檢測及數(shù)據(jù)分析 分別配制分離膠（濃度10%，pH值8.8）和濃縮膠（濃度5%，pH值6.8），然后分別灌入分離膠和濃縮膠，蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液（5×loading buffer）按4∶1混勻，加入5μL彩色預(yù)染蛋白Marker后上樣，按上層膠電壓為80V，30min電泳；下層膠電壓為120V，直至溴酚蘭距離底端0.5cm時(shí)，電泳終止，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。設(shè)置恒流300mA，恒壓15V，80min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，封閉過夜。用稀釋后的一抗（HSP70和HSP90抗體1∶500；GAPDH內(nèi)參抗體1:1000）孵育PVDF膜，4℃過夜或室溫水平搖床孵育1～2h 后，洗膜 4 次，每次 7min。 用 TBST（1∶3000～1∶5000）稀釋二抗，并孵育 2h，然后連續(xù)洗膜 5 次，每次 7min。將配制好的ECL化學(xué)試劑A液與B液滴到PVDF膜上，反應(yīng)3min后，應(yīng)用超靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)Gelcapture Chemi進(jìn)行成像。用GelQuant分析軟件對(duì)目的蛋白灰度值進(jìn)行半定量分析，取目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值之比（或灰度比值）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，用 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，利用SPSS17.0軟件中One-Way ANONA法的Tukey HSD和LSD進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著用p＜0.05表示，差異極顯著用p＜0.01表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 運(yùn)輸前后肉牛血清HSP70含量的檢測結(jié)果與分析

運(yùn)輸前后肉牛血清HSP70含量的檢測結(jié)果見表2。由表2可知，抗應(yīng)激1號(hào)組運(yùn)輸后和運(yùn)輸前同對(duì)照組相比，血清中HSP70濃度均極顯著減少（p＜0.01），抗應(yīng)激2號(hào)組運(yùn)輸前較抗應(yīng)激1號(hào)組極顯著增加（p＜0.01）。相對(duì)于運(yùn)輸前，各組運(yùn)輸后血清HSP70含量均有升高趨勢，其中抗應(yīng)激1號(hào)組運(yùn)輸后的增加幅度極顯著高于抗應(yīng)激2號(hào)組(p＜0.01)，但與對(duì)照組相比差異不顯著(p＞0.05)。由此可見，運(yùn)輸使肉牛血清HSP70含量升高，而飼喂抗應(yīng)激添加劑1號(hào)可以明顯增加運(yùn)輸后肉牛血清的HSP含量。

2.2 運(yùn)輸后肉牛肌肉組織中HSP27、HSP70和HSP90 mRNA的表達(dá)量

運(yùn)輸后各組肉牛肌肉組織內(nèi)HSP27、HSP70和HSP90 mRNA表達(dá)水平的檢測結(jié)果見表3。由表3可知，運(yùn)輸后，抗應(yīng)激添加劑組肉牛肌肉中HSP27 mRNA表達(dá)量均比對(duì)照組低，且抗應(yīng)激1號(hào)組較對(duì)照組和抗應(yīng)激2號(hào)組均顯著降低（p＜0.05），抗應(yīng)激2號(hào)組與對(duì)照組差異不明顯（p＞0.05）。兩個(gè)抗應(yīng)激添加劑組HSP70 mRNA表達(dá)量比對(duì)照組顯著降低 （p＜0.05），抗應(yīng)激1號(hào)組同抗應(yīng)激2號(hào)組之間差異不大 （p＞0.05）。抗應(yīng)激添加劑組HSP90 mRNA的表達(dá)量均較對(duì)照組明顯降低（抗應(yīng)激1號(hào)組：p＜0.05；抗應(yīng)激2號(hào)組：p＞0.05），兩個(gè)抗應(yīng)激添加劑組之間差異不顯著（p＞0.05）。

2.3 運(yùn)輸后各組肉牛肌肉組織中HSP70和HSP90蛋白的表達(dá)量

運(yùn)輸后肉牛肌肉組織中HSP70和HSP90蛋白表達(dá)量的檢測結(jié)果見圖1和表4。

表2 運(yùn)輸前后肉牛血清HSP70含量的檢測結(jié)果Table 2 Serum HSP70 content of beef cattle before and after transportation /ng·L-1

表3 運(yùn)輸后肉牛肌肉組織中HSP27、HSP70和HSP90 mRNA的表達(dá)量Table 3 The mRNA expression of HSP27,HSP70 and HSP90 in beef muscle tissue after transportation

由圖1和表4可知，運(yùn)輸后，抗應(yīng)激添加劑組肉牛HSP70蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組明顯減少（p＜0.01），兩個(gè)抗應(yīng)激添加劑組之間表達(dá)量差異不明顯（p＞0.05），但抗應(yīng)激添加劑2號(hào)組較抗應(yīng)激添加劑1號(hào)組略高；抗應(yīng)激添加劑組HSP90蛋白的表達(dá)量均較對(duì)照組明顯減少（p＜0.05），抗應(yīng)激添加劑2號(hào)組表達(dá)量較抗應(yīng)激1號(hào)組略高，但差異不顯著（p＞0.05）。

圖1 HSP70和HSP90蛋白相對(duì)表達(dá)量的檢測結(jié)果Figure 1 Relative expression of HSP70 and HSP90

表4 運(yùn)輸后肉牛肌肉組織中HSP70和HSP90蛋白表達(dá)水平的檢測結(jié)果Table 4 Relative expression levels of HSP70 and HSP90 protein in muscle tissues of beef cattle after transportation

3 討論與結(jié)論

1962年，RITOSSA[18]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，過熱的環(huán)境中果蠅唾液腺染色體會(huì)出現(xiàn)疏松部形態(tài)上的變化。到了1974年，TISSIERES等[19]才證實(shí)這種變化是因?yàn)檫^熱環(huán)境激發(fā)了染色體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄，合成了一組具有特殊功能的蛋白質(zhì)，即HSPs，伴隨其合成，其余蛋白質(zhì)的合成將會(huì)受到相應(yīng)抑制。HSPs廣泛存在于生物界，保守性很高，當(dāng)細(xì)胞受到一系列不利刺激時(shí)（例如高溫、缺氧、缺血、感染等），它會(huì)迅速的大量合成，并和細(xì)胞內(nèi)一部分變性了的蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合，從而發(fā)揮保護(hù)作用。當(dāng)機(jī)體發(fā)生應(yīng)激時(shí)，HSPs的出現(xiàn)標(biāo)志著細(xì)胞啟動(dòng)自我保護(hù)。有研究證明，HSP70結(jié)構(gòu)高度保守，具有很多生物學(xué)功能，除了對(duì)遭受應(yīng)激的動(dòng)物機(jī)體具有一定的保護(hù)作用外，還可以作為佐劑[20-21]，是機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)生成量最多的應(yīng)激蛋白家族成員之一[22-23]，能夠幫助新合成的多肽鍵的延展和折疊，并可糾正多肽鏈的錯(cuò)誤折疊等。當(dāng)機(jī)體遭受應(yīng)激源刺激時(shí)，體內(nèi)的應(yīng)激蛋白會(huì)急劇升高，其含量會(huì)發(fā)生急劇變化，繼而穩(wěn)定改變的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，維持細(xì)胞的生存[24-25]。HSP的生物學(xué)作用非常多，涉及的方面也越來越廣，很多學(xué)者認(rèn)為HSP可以作為應(yīng)激指征[26]。周京軍等[27]曾發(fā)現(xiàn)，受應(yīng)激刺激的心肌細(xì)胞因HSP70表達(dá)量增加而受到保護(hù)，心肌細(xì)胞恢復(fù)其功能的時(shí)間會(huì)大大縮短，心肌梗死面積也會(huì)顯著縮小。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)輸可導(dǎo)致肉牛血清HSP70含量和肌肉HSP70表達(dá)量明顯增加，這可能與機(jī)體對(duì)抗運(yùn)輸應(yīng)激帶來的危害有關(guān)。

有資料顯示，HSP90和HSP70兩種應(yīng)激蛋白可以與其他分子一起行使調(diào)節(jié)功能，尤其在心肌細(xì)胞內(nèi)，如果HSP90含量升高則可降低或者減少發(fā)生心梗的程度和范圍[28-29]，而HSP90在心臟中含量的減少會(huì)增加發(fā)生心臟病的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致死亡率升高。本試驗(yàn)中，運(yùn)輸后肉牛肌肉組織中3種應(yīng)激蛋白HSP27、HSP70和HSP90在mRNA水平的表達(dá)量，以及HSP70和HSP90在蛋白水平的表達(dá)量均明顯增加，尤其是HSP70的蛋白表達(dá)量極顯著升高。由此推測，運(yùn)輸可能通過誘發(fā)應(yīng)激反應(yīng)而明顯增加肉牛肌肉組織中3種應(yīng)激蛋白HSP27、HSP70和HSP90的含量。而飼喂抗應(yīng)激添加劑的兩組幾種應(yīng)激蛋白的含量均較對(duì)照組低，雖然運(yùn)輸后應(yīng)激蛋白的增加可以緩解運(yùn)輸導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)所帶來的機(jī)體損害，但機(jī)體短期迅速地合成應(yīng)激蛋白可能會(huì)過度消耗體內(nèi)的能源物質(zhì)，飼喂抗應(yīng)激添加劑有望避免應(yīng)激反應(yīng)后應(yīng)激蛋白急劇大量合成所造成的過度消耗，而抗應(yīng)激1號(hào)組運(yùn)輸前和運(yùn)輸后血清HSP明顯均較其他組低，但其運(yùn)輸后較運(yùn)輸前增加幅度要高于其他兩組，尤其是顯著高于抗應(yīng)激2號(hào)組，顯然抗應(yīng)激1號(hào)添加劑抵抗應(yīng)激、減少機(jī)體消耗的效果較2號(hào)添加劑更明顯。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，屠宰前的運(yùn)輸會(huì)導(dǎo)致肉牛血液和肌肉中應(yīng)激蛋白含量增加，從一定程度上可以緩解運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)機(jī)體造成的損害，但運(yùn)輸過程中的驚恐和高度緊張狀態(tài)使畜體自身營養(yǎng)消耗加快，運(yùn)輸應(yīng)激使機(jī)體快速合成大量應(yīng)激蛋白，從而導(dǎo)致體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的過度消耗。研究中運(yùn)輸前飼喂抗應(yīng)激添加則可以有效緩解了這種狀況，這將有利于機(jī)體穩(wěn)態(tài)的維持，提高機(jī)體抗應(yīng)激能力。所以，養(yǎng)牛生產(chǎn)中可以考慮在運(yùn)輸前飼喂抗應(yīng)激添加劑，以提高畜體抗應(yīng)激、保持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的能力，有利于生產(chǎn)效益的提高。

綜上所述，運(yùn)輸使肉牛血清和肌肉組織中應(yīng)激蛋白含量增加，而抗應(yīng)激添加劑可影響運(yùn)輸后肉牛血清及肌肉組織中應(yīng)激蛋白的水平，尤以抗應(yīng)激1號(hào)作用更明顯。