萬(wàn)穎寒, 沈如凌, 王 玨, 龔 慧, 李 俊, 董 茹, 費(fèi) 儉,2

(1. 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心/同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院模式生物技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 上海 201203；2. 上海南方模式生物科技股份有限公司 上海模式動(dòng)物工程技術(shù)研究中心, 上海 201318)

小鼠是第一個(gè)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因和基因敲除的哺乳動(dòng)物, 是人類疾病建模的首選模式生物[1]。近交系小鼠的基因高度純化，僅有不到1%的基因存在雜合性。利用近交系小鼠，人們已建立了大量與人類疾病相關(guān)的基因工程小鼠模型，極大地豐富了我們對(duì)人類基因功能和疾病發(fā)病機(jī)制的了解[2]。大部分基因工程小鼠是建立在某個(gè)特定近交品系的，基因工程小鼠的表型不僅來(lái)源于對(duì)靶基因的改造，還強(qiáng)烈地受到遺傳背景的影響，同一個(gè)基因突變?cè)诓煌废当尘靶∈笊峡赡艹霈F(xiàn)不同的表型，其中也包括行為學(xué)表型[3,4]。所以了解不同近交系小鼠及其雜交后代的基本表型特征及差異對(duì)于解釋基因工程小鼠的表型研究結(jié)果是至關(guān)重要的。目前，構(gòu)建和繁育基因工程小鼠常用的近交品系為C57BL/6J和129/SvJ。然而，對(duì)于C57BL/6J和129/SvJ及其雜交后代在行為上的差異尚缺少系統(tǒng)的比較研究。本文通過(guò)對(duì)近交系小鼠C57BL/6J、129/SvJ以及它們F1小鼠的行為研究, 了解不同背景小鼠的行為差異, 為解釋遺傳背景對(duì)基因工程小鼠行為學(xué)表型的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6J、129/SvJ及F1小鼠, 8～15周齡，均由上海南方模式生物科技股份有限公司提供[SCXK(滬)2014-0002]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在屏障設(shè)施 [SYXK(滬)2013-0035] 中完成，小鼠飼養(yǎng)在恒溫(21～22 ℃) 房間, 每隔 12 h 光暗循環(huán)(光照7∶00 am～19∶00 pm)。每日小鼠自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)鼠糧及飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案獲得上海南方模式生物科技股份有限公司動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(20140001, 20160008)。

1.2 主要試劑和儀器

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)儀器購(gòu)自美國(guó)Kinder Scientific Company LLC公司； 水迷宮實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)、鼠博士動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng)均購(gòu)自上海移數(shù)信息科技有限公司；熱板儀器購(gòu)自美國(guó)IITC Inc公司。

1.3 動(dòng)物交配繁育

C57BL/6J(B6), 129/SvJ(129)小鼠同品系交配及品系間交配繁育得到雌雄兩種親代和F1代小鼠,每組小鼠需要交配繁育至少6籠, 以確保親代小鼠[B6(C57BL/6J♀×C57BL/6J♂)、129(129/SvJ♀×129/SvJ♂)、和F1代小鼠[129B6F1(129/SvJ♀×C57BL/6J♂)、B6129F1(C57BL/6J♀×129/SvJ♂)]♂♀比例及數(shù)量不少于12只。

1.4 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

用于行為學(xué)實(shí)驗(yàn)小鼠為8～15周齡、體質(zhì)量20～25 g的成年小鼠，實(shí)驗(yàn)前一周將小鼠轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所的IVC動(dòng)物房飼養(yǎng), 使之適應(yīng)新的環(huán)境。

小鼠的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)均在獨(dú)立安靜的房間內(nèi)進(jìn)行, 測(cè)試和記錄的房間與操作人員的觀察房間分離。小鼠在實(shí)驗(yàn)開始之前, 移入實(shí)驗(yàn)環(huán)境，適應(yīng)30 min。每個(gè)小鼠測(cè)試完成后，取走動(dòng)物，清理儀器裝置中小鼠留下的尿液和糞便, 用體積分?jǐn)?shù)75 %乙醇溶液擦拭小鼠接觸過(guò)的區(qū)域, 并用吸水紙擦去殘余乙醇，待乙醇揮發(fā)后再放入另一只小鼠進(jìn)行測(cè)試, 保證小鼠之間不會(huì)因氣味相互影響。

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)選擇了針對(duì)焦慮、抑郁、學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)、熱痛等測(cè)定指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度從低到高安排(圖1), 實(shí)驗(yàn)之間確保小鼠得到充分休息。

1.4.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 小鼠的運(yùn)動(dòng)具有趨壁性，天生害怕空曠場(chǎng)地，喜歡在邊緣和角落活動(dòng)，因此曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)利用一個(gè)大面積開放的區(qū)域作為刺激源使小鼠產(chǎn)生焦慮感，評(píng)價(jià)小鼠的探究行為、自主活動(dòng)以及緊張度[5]。實(shí)驗(yàn)在方形有機(jī)玻璃盒中進(jìn)行，上方有日光燈照明,小鼠自由探索15 min。小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡由紅外探測(cè)記錄，傳輸至系統(tǒng)軟件分析(KS moter monitor)。

1.4.2 懸尾實(shí)驗(yàn) 利用小鼠在尾巴被懸吊的短期、不可避免的壓力下，會(huì)形成一種不動(dòng)的姿勢(shì)，來(lái)評(píng)估小鼠的抑郁程度[6]。使用醫(yī)用膠布將小鼠的尾巴吊在距桌面50 cm高的金屬環(huán)上。攝像頭記錄小鼠的活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為6 min, 0～2 min為適應(yīng)時(shí)間, 分析統(tǒng)計(jì)2～6 min小鼠的不動(dòng)時(shí)間。

1.4.3 水迷宮實(shí)驗(yàn) 水迷宮是對(duì)嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)的測(cè)試，它依靠遠(yuǎn)端線索從開放游泳場(chǎng)所周邊的起始位置導(dǎo)航到水下逃生平臺(tái)，專門用來(lái)評(píng)估小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力[7]。實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[8,9]設(shè)置，分7 d進(jìn)行： 1 d為適應(yīng)期，水中不設(shè)逃生平臺(tái)，池壁上不貼標(biāo)記位置的白紙片，小鼠面朝池壁被放入水池中，自由游泳2 min。2～6 d為訓(xùn)練期，在水中設(shè)逃生平臺(tái)，在池壁貼上標(biāo)記位置的白紙片，平臺(tái)隱藏在水下1 cm處。每日每只小鼠分別從4個(gè)象限被放入水池中進(jìn)行4次訓(xùn)練。第7日為測(cè)試期，水中不設(shè)逃生平臺(tái)，池壁上保留標(biāo)記，游泳1 min，上方攝像頭記錄小鼠游泳軌跡。

1.4.4 被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn) 利用厭惡刺激來(lái)達(dá)到學(xué)習(xí)的目的, 評(píng)估嚙齒類動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力[10,11]。實(shí)驗(yàn)分3 d進(jìn)行： 1 d為適應(yīng)期，將小鼠放入明場(chǎng)令其探索30 s, 之后打開閘門, 讓小鼠在明暗場(chǎng)中自由探索，時(shí)間5 min。24 h進(jìn)行訓(xùn)練，將小鼠放入明箱中，30 s后打開閘門，觀察到小鼠四肢全部進(jìn)入暗箱, 關(guān)閉閘門, 給予小鼠0.3 mA持續(xù)3 s的電流刺激，電流刺激過(guò)后30 s，拿出小鼠。48 h進(jìn)行測(cè)試，將小鼠放入明箱，5s后打開閘門。小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡由紅外探測(cè)記錄，傳輸至系統(tǒng)軟件分析(KS moter monitor)。

1.4.5 熱板實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)在被均勻加熱的黑色陽(yáng)極氧化鋁板上進(jìn)行。IITC熱板鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)用于小鼠的熱敏感潛伏期測(cè)試。打開熱板裝置，將熱板表面加熱至(55±0.2) ℃的恒溫。將小鼠放在熱板上，并被一個(gè)透明的丙烯酸保護(hù)套包圍，當(dāng)測(cè)試的小鼠顯示舔后爪，輕拂或跳躍時(shí)，立即從熱板上取出小鼠并放回籠中，記錄時(shí)間[12]。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用Graphpad5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用ONE WAY ANVOA和TWO WAY ANVOA方法統(tǒng)計(jì)，并作圖。數(shù)據(jù)用±s表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

圖2 雄性小鼠曠場(chǎng)活動(dòng)表現(xiàn)

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)顯示, 雄性組小鼠129相比于B6在邊緣活動(dòng)的時(shí)間顯著增長(zhǎng)(P＜0.001), 在中央?yún)^(qū)域的活動(dòng)時(shí)間顯著減少(P＜0.001)。 129在中央?yún)^(qū)域與邊緣區(qū)域的運(yùn)動(dòng)路程比、運(yùn)動(dòng)時(shí)間比顯著低于B6(P＜0.001)。F1分別與129、B6比較，在邊緣活動(dòng)的時(shí)間顯著低于129(P＜0.001)； 在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)時(shí)間顯著高于129(P＜0.001)； 在中央?yún)^(qū)域與邊緣區(qū)域的運(yùn)動(dòng)路程比、時(shí)間比顯著高于 129(P＜0.01)。

圖3顯示，雌性組小鼠129相比于B6在邊緣活動(dòng)的時(shí)間顯著增長(zhǎng)(P＜0.001)，在中央?yún)^(qū)域的活動(dòng)時(shí)間顯著減少(P＜0.001)。129在中央?yún)^(qū)域與邊緣區(qū)域的運(yùn)動(dòng)路程比、運(yùn)動(dòng)時(shí)間比顯著低于B6(P＜0.001)。F1 分別與129、B6 比較, 在邊緣活動(dòng)的時(shí)間顯著低于129(P＜0.001), 129B6F1顯著高于B6(P＜0.05)； 在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)時(shí)間顯著高于129(P＜0.001)，129B6F1 顯著低于 B6(P＜0.05)； 在中央?yún)^(qū)域與邊緣區(qū)域的運(yùn)動(dòng)路程比、時(shí)間比顯著高于129(P＜0.01), 129B6F1運(yùn)動(dòng)路程比、時(shí)間比顯著低于B6(P＜0.01,P＜0.05)。

2.2 小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)

結(jié)果顯示， 各實(shí)驗(yàn)組不動(dòng)時(shí)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)抑郁樣指標(biāo)

2.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)

圖3 雌性小鼠曠場(chǎng)活動(dòng)表現(xiàn)

不同背景來(lái)源的雄鼠水迷宮結(jié)果(圖4)表明，隨著訓(xùn)練時(shí)間增加， B6和129找到和爬上逃生平臺(tái)的潛伏期都會(huì)縮短，但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。129B6F1和B6129F1找到和爬上逃生平臺(tái)的潛伏期都會(huì)顯著縮短(P＜0.01)。對(duì)各組小鼠的潛伏期曲線進(jìn)行比較：B6比較129B6F1，在2～5 d均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)； 129比較129B6F1，在4d、5d存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)； 129比較B6129F1，在5 d存在顯著性差異(P＜0.05)。B6129F1在原平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間顯著高于B6(P＜0.05)。

雌性小鼠結(jié)果(圖5)顯示, B6和129找到和爬上逃生平臺(tái)的潛伏期都會(huì)縮短, 且129在5 d顯著低于B6(P＜0.05)。129B6F1和B6129F1找到和爬上逃生平臺(tái)的潛伏期都會(huì)顯著縮短(P＜0.01)。對(duì)各組小鼠的潛伏期曲線進(jìn)行比較：B6比較129B6F1和B6129F1，在5d均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.005)。B6比較B6129F1, 在5d存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。B6129F1的穿越平臺(tái)次數(shù)顯著高于 B6(P＜0.05)。

2.4 被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)

從表2可見, 雄性組B6在3 d進(jìn)入暗箱的潛伏期顯著低于129、B6129F1(P＜0.01)。雌性組B6在3 d進(jìn)入暗箱的潛伏期顯著低于129(P＜0.001)。129B6F1和B6129F1在3 d進(jìn)入暗箱的潛伏期顯著高于 B6(P＜0.001)。

各組小鼠在3 d測(cè)試期進(jìn)入暗箱的時(shí)間顯著高于1 d、2 d訓(xùn)練期(P＜0.001)，在訓(xùn)練2 d小鼠電擊后進(jìn)入暗箱的時(shí)間顯著低于1 d(P＜0.001)。

2.5 小鼠熱痛活動(dòng)表現(xiàn)

B6在熱板上反應(yīng)時(shí)間顯著低于129(P＜0.01)。雄性組小鼠129B6F1在熱板上的反應(yīng)時(shí)間顯著低于129(P＜0.01)； B6129F1在熱板上的反應(yīng)時(shí)間顯著高于 B6(P＜0.001)(圖 6)。

3 討論

我們利用一組行為實(shí)驗(yàn)研究了B6、129以及它們的雜交后代小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)。曠場(chǎng)活動(dòng)中，129比B6表現(xiàn)出更高的焦慮水平，F(xiàn)1在曠場(chǎng)中表現(xiàn)偏向于B6；抑郁樣行為測(cè)試中，各小鼠組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在學(xué)習(xí)記憶測(cè)試中，129的學(xué)習(xí)記憶能力比B6強(qiáng)，而F1和129接近，在水迷宮則表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)；熱板測(cè)試中，B6對(duì)熱痛比129更加敏感，在F1中，其行為主要由父系決定。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是廣泛用于評(píng)估嚙齒類動(dòng)物焦慮樣狀態(tài)和測(cè)試抗焦慮藥物藥效的最常用測(cè)試手段[13]，測(cè)試是基于接近/回避沖突，動(dòng)物表現(xiàn)出更愿意探索明亮、開放和升高的區(qū)域被認(rèn)為“低焦慮水平”。本文結(jié)果表明, 129較B6表現(xiàn)更為焦慮, 這也與文獻(xiàn)報(bào)道[14,15]吻合。我們發(fā)現(xiàn)F1代在焦慮行為上主要受到B6的背景影響，在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中F1代雄性小鼠與129之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001),但和B6無(wú)顯著差異，因此B6背景更多地影響了F1在曠場(chǎng)環(huán)境下焦慮行為的表現(xiàn)，相對(duì)顯性。

圖4 雄性小鼠水迷宮表現(xiàn)

圖5 雌性小鼠水迷宮表現(xiàn)

表2 小鼠被動(dòng)回避潛伏期 s

在學(xué)習(xí)記憶測(cè)試中，我們考察了小鼠在水迷宮和被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)的認(rèn)知表現(xiàn)。認(rèn)知和信息加工能力的評(píng)估是精神疾病機(jī)制研究和認(rèn)知增強(qiáng)藥物臨床前研究的重要工具[16,17]。水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力，是揭示海馬依賴性空間學(xué)習(xí)記憶能力改變的敏感方法[18]。被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)以電擊的方式給予小鼠一個(gè)厭惡刺激促使其違背先天的偏好，達(dá)到評(píng)估其學(xué)習(xí)能力的目的。被動(dòng)回避是一種杏仁核依賴性測(cè)試，評(píng)估小鼠學(xué)習(xí)和保持聯(lián)想規(guī)則的能力。在水迷宮中B6和129行為表現(xiàn)沒有顯著性差異，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)在目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間和穿臺(tái)次數(shù)上129表現(xiàn)出學(xué)習(xí)能力略優(yōu)于B6(P=0.06，P=0.07)，若增加樣本數(shù)，也許結(jié)果會(huì)有顯著性的差異。在被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)中，129對(duì)電刺激的敏感度和記憶能力顯著高于B6。F1表現(xiàn)出比兩種親代顯著優(yōu)異的空間學(xué)習(xí)記憶能力，但在被動(dòng)回避表現(xiàn)上與129差異不顯著，因此在決定學(xué)習(xí)記憶方面，129背景影響相對(duì)顯性。

在熱痛敏感性測(cè)試中，雄性F1對(duì)熱敏感的行為特征和父代親本品系類似，表現(xiàn)出父系遺傳的特點(diǎn)，但該遺傳特征在雌性F1中沒有觀察到，而是表現(xiàn)為和129背景更接近。

圖6 小鼠熱板活動(dòng)表現(xiàn)

小鼠的行為特征是深受品系背景影響的, 而年齡的差異也會(huì)對(duì)小鼠的行為產(chǎn)生不同的影響，造成數(shù)據(jù)的不一致，說(shuō)明了表型和基因型之間的復(fù)雜關(guān)系。大規(guī)模行為測(cè)試數(shù)據(jù)分析表明, B6小鼠從成年到中年(2～3、4～5、6～7、8～12 月齡組)，在明暗箱、曠場(chǎng)活動(dòng)、高架十字迷宮、爬桿、社交互動(dòng)、預(yù)脈沖抑制、強(qiáng)迫游泳、懸尾實(shí)驗(yàn)的各種行為表現(xiàn)中存在與年齡相關(guān)的變化[19]。我們?cè)?jīng)研究過(guò)10周齡B6和129小鼠在水迷宮中的表現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B6的表現(xiàn)更好，和本次我們用的14周左右的小鼠的研究結(jié)果不一致[20]。

了解不同近交系小鼠的基本行為表現(xiàn)對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)基因及精神科疾病機(jī)制研究尤為重要。本文初步探討了B6、129以及其雜交后代F1的行為表現(xiàn), 為基因工程小鼠的表型研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。