宋早智 王慶康 孫家和 劉雪 錢(qián)軍

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科（安徽蚌埠233000）

胃癌（gastric cancer）是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，胃癌的發(fā)病率在世界排在第五位，而其死亡率達(dá)到了第3 位。而在中國(guó)，胃癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排在第2 位，死亡率排在第3 位。各國(guó)的癌癥數(shù)據(jù)報(bào)告顯示，近幾年的胃癌發(fā)病率趨于穩(wěn)定并有逐年下滑的趨勢(shì)，但我國(guó)的胃癌發(fā)病率仍舊很高，占世界總發(fā)病率的40%以上［1-2］。

類(lèi)端粒沉默干擾體1（disruptor of telomeric silencing 1-like，DOTIL）是一個(gè)在進(jìn)化上保守的蛋白，在芽殖酵母（Saccharomyces cerevisiae）中通過(guò)篩選遺傳基因時(shí)被首次發(fā)現(xiàn)，在低等生物中被稱(chēng)為DOT1（disruptor of telomeric silencing 1）蛋白，而在哺乳動(dòng)物中保守的同源蛋白被稱(chēng)為DOT1 樣蛋白，DOT1L 的過(guò)量表達(dá)則可以擾亂端粒的沉默。有研究表明DOT1L 不僅在白血?。?］中起關(guān)鍵作用，在實(shí)體腫瘤中也有重要作用，乳腺癌中提高DOT1L 表達(dá)量，可能增加BCAT1 表達(dá)，從而導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞球形形成和細(xì)胞遷移活性的改變［4］。卵巢癌中，DOT1L 通過(guò)H3K79 甲基化過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控CDK6 和CCND3 來(lái)驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)展，提示DOT1L 可能是卵巢癌預(yù)后評(píng)估和治療干預(yù)的潛在靶點(diǎn)［5］。前期筆者通過(guò)Western Blot 發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，胃癌新鮮組織中DOT1L 表達(dá)量增高。然而尚未有學(xué)者就DOT1L 在胃癌中的表達(dá)及作用進(jìn)行報(bào)道。因此，本研究通過(guò)免疫組化檢測(cè)80例胃癌及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中DOT1L 表達(dá)情況，旨在探討DOT1L 在胃癌中表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院于2018年6-12月在腫瘤外科進(jìn)行胃癌手術(shù)患者25例。所有病人術(shù)前均未接受過(guò)放療化療及其他抗腫瘤治療，并于術(shù)前均有明確診斷及術(shù)后再次診斷為癌。共納入25例癌組織及其相匹配的正常非癌性胃黏膜組織（距離腫瘤邊緣＞4 cm）。手術(shù)切除后，立即放入-80 ℃冰箱保存，直至提取mRNA 及蛋白質(zhì)。本研究已經(jīng)通過(guò)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并取得患者知情同意。

1.2 主要試劑TRIzol?Plus RNA Purification Kit和Revert Aid First Strand cDNA short kit 由美國(guó)Invitrogen 公司生產(chǎn)；Power SYBR?Green PCR Master Mix 由瑞士Roche 公司生產(chǎn)；兔抗人DOT1L 單克隆抗體及兔抗人β-actin 單克隆抗體、鼠抗兔IgG 二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒由美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司生產(chǎn)。

1.3 胃癌DOT1L mRNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄及qRTPCR 反應(yīng)取胃癌及相配對(duì)的癌旁正常組織，使用TRIzol-氯仿-異丙醇法提取總RNA 后，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（引物由上海吉?jiǎng)P公司提供，引物序列見(jiàn)表1，以cDNA 為模板，β-actin 為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法計(jì)算DOT1L 的表達(dá)量。反應(yīng)條件：（1）變性95 ℃15 s，（2）退火60 ℃25 s，（3）延伸72 ℃34 s。共40 個(gè)循環(huán)。

表1 PCR 引物序列表Tab.1 PCR primer sequence table

1.4 Western Blot 檢測(cè)胃癌組織中DOT1L 蛋白取胃癌及相配對(duì)的癌旁正常組織，提取總蛋白，BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取60 μL 總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后以4%BSA封閉2 h，漂洗。DOT1L 一抗以1∶1 000 稀釋?zhuān)?actin 一抗以1∶2 000 稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜，漂洗。二抗以1∶5 000 稀釋?zhuān)覝胤跤? h，T-TBS 漂洗，顯色。用Image J 分析目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值來(lái)計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 免疫組化檢測(cè)DOT1L 蛋白選取蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院于2013年1月到2013年12月在腫瘤外科手術(shù)的胃癌組織蠟塊80例，進(jìn)行切片制備、脫臘、復(fù)水后對(duì)組織進(jìn)行抗原修復(fù)，然后進(jìn)行免疫反應(yīng)，滴加一抗（1∶200），4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。加二抗（1∶500），室溫孵育1 h。DAB 化學(xué)染色，蘇木素復(fù)染。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。陽(yáng)性染色結(jié)果判斷：胞漿中的染色面積和棕黃色顆粒決定是否為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.6 免疫組化結(jié)果判斷采用二次計(jì)分法：每例標(biāo)本隨機(jī)計(jì)數(shù)5 個(gè)高倍視野（× 400），計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野中陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)如下［6］：以基本色度標(biāo)準(zhǔn)，0 分無(wú)色，1 分淡黃色，2分棕黃色，3 分棕褐色。再將陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分，0 分為陰性，1 分為陽(yáng)性細(xì)胞＜10%，2 分為11%～50%，3 分為51%～75%，4 分為＞75%。用染色強(qiáng)度得分和細(xì)胞數(shù)得分的乘積作為判斷表達(dá)結(jié)果，若積分0～4 分為陰性，4～12 分為陽(yáng)性。因此，本研究將DOT1L 陰性表達(dá)患者歸為低表達(dá)組，陽(yáng)性表達(dá)歸為高表達(dá)組。免疫組化結(jié)果由兩名以上高年資病理醫(yī)師同時(shí)讀片評(píng)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，單因素及多因素分析采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，生存分析采用Kaplan-Meier 法計(jì)算。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DOT1L mRNA 在胃癌組織中表達(dá)與癌旁正常組織相比，胃癌組織中DOT1L mRNA 的表達(dá)水平明顯增加，兩者差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 胃癌組織與對(duì)應(yīng)癌旁正常組織DOT1L mRNA 的表達(dá)Fig.1 Expression of DOT1L mRNA in gastric cancer tissues and adjacent tissues

2.2 DOT1L蛋白表達(dá)在胃癌組織中的表達(dá)DOT1L蛋白在170 kDa 處出現(xiàn)，以β-actin 為內(nèi)參對(duì)照，DOT1L 蛋白在胃癌組織中明顯高于癌旁正常組織中表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖2 胃癌組織（T）與癌旁正常組織（N）DOT1L 蛋白表達(dá)狀況Fig.2 Expression of DOT1L protein in gastric cancer tissue（T）and paracancer normal tissue（N）

2.3 免疫組化檢測(cè)DOT1L 蛋白表達(dá)在80例胃癌組織蠟塊和與其相匹配的癌旁正常組織中，DOT1L 蛋白在癌組織中陽(yáng)性表達(dá)明顯高于癌旁正常組織（P＜0.001），見(jiàn)表2。DOT1L 陽(yáng)性反應(yīng)物定位于細(xì)胞胞漿中，見(jiàn)圖3。

表2 DOT1L 在胃癌組織和癌旁正常組織的表達(dá)情況Tab.2 Expression of DOT1L in gastric cancer tissues and adjacent tissues 例（%）

圖3 免疫組化檢測(cè)DOT1L 蛋白在胃癌和癌旁正常組織的表達(dá)（×400）Fig.3 The expression of DOT1L protein in gastric cancer and adjacent normal tissues was detected by immunohistochemistry

2.4 DOT1L 蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性為了闡明DOT1L 潛在的預(yù)后作用，通過(guò)對(duì)免疫組化結(jié)果與患者臨床病理資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可以發(fā)現(xiàn)，DOT1L 在胃癌中的表達(dá)與DOT1L 蛋白的表達(dá)量與分化程度（P＝0.002）、TNM 分期（P＝0.022）、淋巴轉(zhuǎn)移（P＝0.032）有關(guān)，與年齡（P＝0.251）、性別（P＝0.808）、腫瘤部位（P＝0.450）、腫瘤大?。≒＝0.489）和浸潤(rùn)深度（P＝0.703）無(wú)關(guān)，見(jiàn)表3。

2.5 DOT1L蛋白表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系本組80例患者隨訪時(shí)間60 個(gè)月，死亡62 人，總生存率22.5%。對(duì)DOT1L 在胃癌中的表達(dá)進(jìn)行K-M 分析，胃癌組織中DOT1L 陽(yáng)性患者總體生存率（P＜0.001）顯著高于DOT1L 陰性患者，見(jiàn)圖4。

2.6 胃癌預(yù)后單因素及多因素分析采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析后，單因素結(jié)果顯示，DOT1L 陽(yáng)性表達(dá)，侵犯程度T3-T4，TNM分期高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分化程度低是影響胃癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素。多因素分析顯示，DOT1L陽(yáng)性表達(dá)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期高是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素（均P＜0.05），見(jiàn)表4。

圖4 胃癌患者DOT1L 高表達(dá)組與DOT1L 低表達(dá)組5年生存率比較Fig.4 The 5 years survival rate in the DOT1L overexpression group was significantly lower than that in the DOT1L low expression group

3 討論

近些年來(lái)，胃癌的治療主要方式仍是以手術(shù)治療為主，術(shù)前新輔助化療和術(shù)后化療放療相結(jié)合為輔。這對(duì)于胃癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，明顯提高了手術(shù)的療效和患者的生存時(shí)間，但仍有超過(guò)一半的患者發(fā)生了局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［7］。因此，對(duì)于胃癌患者早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療對(duì)于病情控制、治療方式選擇、生存時(shí)間顯得尤為重要。通常胃癌通過(guò)鋇劑造影，彩超等進(jìn)行篩查。而早期確診則要通過(guò)胃鏡取材，病理檢驗(yàn)得到。這種方法入侵性強(qiáng)，傷害較大，對(duì)于患者較為不利。因而尋找胃癌相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)，通過(guò)血清腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)對(duì)于早期胃癌的篩查具有重要意義。

表3 DOT1L 表達(dá)與患者臨床病理因素的關(guān)系Tab.3 Relationship between DOT1L expression and clinicopathological factors in patients

眾所周知，DOT1L 作為酵母中DOT1 的人類(lèi)同源物，是組蛋白H3 第79 位賴(lài)氨酸（H3K79）的特異性的甲基轉(zhuǎn)移酶。最近的研究表明，DOT1L 通過(guò)與MLL 融合伴侶蛋白（例如AF4，AF9，AF10 或ENL）結(jié)合，參與混合譜系白血?。∕LL）- 重排白血病的起始和維持，導(dǎo)致H3K79 甲基化和過(guò)表達(dá)異常［8-10］。因此，對(duì)于這種類(lèi)型的白血病，DOT1L的小分子抑制劑是一個(gè)非常重要的治療靶點(diǎn)［11］。在實(shí)體臟器的惡性腫瘤中，YANG 等［12］認(rèn)為，DOT1L 表達(dá)較高，經(jīng)過(guò)腎透明細(xì)胞癌手術(shù)后的病人，其生存時(shí)間分期預(yù)后都較低表達(dá)患者更差。然而在紫外線誘導(dǎo)的黑色素瘤中，ZHU 等［13］卻發(fā)現(xiàn)，DOT1L 和甲基化的H3K79 結(jié)合到DNA 損傷位點(diǎn)進(jìn)行核苷酸切除修復(fù)，這表明，DOT1L 在紫外線誘導(dǎo)的黑色素瘤過(guò)程中起保護(hù)作用。這種與重排型白血病中DOT1L 所對(duì)應(yīng)的靶基因不同，從而產(chǎn)生不一樣的作用。

表4 DOT1L 表達(dá)以及臨床特征對(duì)胃癌患者生存率的影響Tab.4 Impacts of DOT1L expressions，as well as clinical characteristics on the survival rates of gastric cancer patients

DOT1L 在腫瘤細(xì)胞的侵襲增殖信號(hào)途徑中起著重要作用。在本課題中，筆者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，正常胃組織中DOT1L 的表達(dá)情況明顯低于癌組織中的表達(dá)，并且DOT1L 蛋白的表達(dá)與分化程度、TNM 分期、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。通過(guò)多因素分析，DOT1L 高表達(dá)、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與胃癌患者預(yù)后有明顯的相關(guān)性。這些都提示DOT1L 可能是一種原癌基因，由此我們可以判斷，檢測(cè)胃癌組織中DOT1L 蛋白量有助于判斷腫瘤的惡性程度和進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。但此實(shí)驗(yàn)仍無(wú)法對(duì)DOT1L 在胃癌中分子機(jī)制層面進(jìn)行研究。下一步我們將進(jìn)行胃癌不同種細(xì)胞間差異性分析，并通過(guò)敲低DOT1L 表達(dá)量，觀察細(xì)胞增殖變化，

綜上所述，DOT1L 在胃癌組織中存在基因和蛋白高表達(dá)的現(xiàn)象，其表達(dá)的強(qiáng)弱與胃癌的臨床病理學(xué)具有相關(guān)性。