李強(qiáng) 陸士娟 鐘江華 黃康 羊慧君 何雅歌 鐘贊蕊

中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院心內(nèi)科（?？?70208）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，在歐美發(fā)達(dá)國家冠心病發(fā)病率約 5%［1］。而經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）是冠心病的重要治療手段之一。PCI 術(shù)后可以促進(jìn)血小板活化聚集，誘發(fā)支架內(nèi)血栓形成，引起栓塞、再次心梗、死亡等主要不良心血管事件（major adverse cardiovascular events，MACE）。因此PCI 術(shù)后患者常規(guī)進(jìn)行抗血小板治療。而阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷雙聯(lián)抗血小板治療，是PCI 術(shù)后患者抗血小板治療的基石用藥［2-4］。但不同個(gè)體對(duì)氯吡格雷的反應(yīng)顯著差異［5-7］，其中遺傳因素可能導(dǎo)致氯吡格雷血小板反應(yīng)差異是目前的研究熱點(diǎn)。根據(jù)候選基因法，ABCB1 C3435T、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17、PON1 Q192R、CES1A2 A（-816）C 是氯吡格雷代謝酶及轉(zhuǎn)運(yùn)體基因上單核苷酸多態(tài)。這些突變使轉(zhuǎn)運(yùn)體及代謝酶結(jié)構(gòu)或活性改變，影響氯吡格雷吸收、代謝及轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致氯吡格雷血小板反應(yīng)差異［8-15］。GAWS 位點(diǎn)：rs342293 是喀什米人全基因組掃描關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）研究［16］得到的新位點(diǎn)，可能與CYP2C19*2存在連鎖不平衡而影響氯吡格雷血小板反應(yīng)。但遺傳因素受種族與地域影響，在中國人群中，ABCB1 C3435T、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17、PON1 Q192R、CES1A2 A（-816）C、GAWS 位點(diǎn)：rs342293 這些SNPs 對(duì)氯吡格雷的抗血小板反應(yīng)性影響目前尚未得出一致結(jié)論［17］。并且在中國人群中尚無相關(guān)研究同時(shí)探討上述的7 個(gè)SNPs 對(duì)氯吡格雷的抗血小板反應(yīng)差異的影響。因此，本研究將探討遺傳因素中的氯吡格雷代謝酶及轉(zhuǎn)運(yùn)體基因多態(tài)（CYP2C19、ABCB1、CES1A2、PON1 等基因多態(tài)性）對(duì)冠心病PCI 術(shù)患者氯吡格雷血小板反應(yīng)差異的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料納入2015年6月至2016年3月，海口市人民醫(yī)院及湘雅三醫(yī)院心內(nèi)科2 個(gè)中心，明確診斷為冠心病，并行擇期PCI 或急診PCI 術(shù)的患者143例。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡＞18 歲；經(jīng)過冠狀動(dòng)脈造影確診為冠心?。ò║A、NSTEMI、STEMI 及穩(wěn)定型心絞痛、缺血性心肌?。┎⒔邮苤Ъ苤踩胄g(shù)及阿司匹林和氯吡格雷雙聯(lián)抗血小板治療。排除對(duì)阿司匹林或氯吡格雷過敏或不能耐受者；半年內(nèi)有中風(fēng)或內(nèi)臟出血性疾病史、不能按要求服用雙聯(lián)抗血小板治療者；嚴(yán)重肝臟疾患和/或凝血功能異常、不能按要求服用雙聯(lián)抗血小板治療者；具有抗血小板治療禁忌證或近期擬行手術(shù)者；合并其他終末期疾病者。簽署知情同意書，遵循自愿參與的原則。

1.2 給藥方案及血樣收集

1.2.1 給藥方案根據(jù)臨床實(shí)際要求，PCI 術(shù)前采用負(fù)荷劑量或維持劑量給藥方案。負(fù)荷劑量方案為硫酸氫氯吡格雷（300 mg/600 mg，波立維，Sanofi Aventis公司，法國）+阿司匹林腸溶片（100 mg/300 mg，拜阿司匹靈，Bayer 公司，德國）雙聯(lián)抗血小板治療。維持劑量方案為硫酸氫氯吡格雷（75 mg/d）+阿司匹林腸溶片（100 mg/d）5 d 以上。

1.2.2 血樣收集根據(jù)PCI術(shù)后患者是否使用替羅非班，選擇不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行血小板反應(yīng)檢測：（1）使用替羅非班患者，于使用結(jié)束后，至少洗脫24 h 后采血檢測；（2）未使用替羅非班患者，于PCI 術(shù)后12～24 h 內(nèi)檢測血小板反應(yīng)。使用3.8%枸櫞酸鈉抗凝管，收集3 mL外周靜脈血用于檢測，常溫保存，48 h 之內(nèi)檢測，有溶血或凝血的樣本不得使用。同時(shí)使用EDTA 抗凝管收集5 mL 外周靜脈血，置于-80 ℃凍存，以備后續(xù)提取DNA進(jìn)行基因檢測。

1.3 血小板反應(yīng)檢測按照血管擴(kuò)張刺激磷蛋白（VASP）檢 測 試 劑 盒（PLTVASP/P2Y12，BIOCYTEX，法國）說明書提供標(biāo)準(zhǔn)流程，采用流式細(xì)胞儀BD FACSalibue（美國）檢測血小板反應(yīng)指數(shù)（platelet reactivity index，PRI）評(píng)估氯吡格雷的抗血小板作用。VASP 作為血小板細(xì)胞內(nèi)磷酸化狀態(tài)的衡量指標(biāo)，用于抗血小板聚集藥物的監(jiān)測，是血小板ADP 受體拮抗劑（抗P2Y12 藥物）的特異性監(jiān)測指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林對(duì)PLT VASP/P2Y12 檢測不存在有效干擾。

1.4 基因型檢測采用Genomic DNA Purification Kit（Promega）試劑盒，根據(jù)說明書流程提取人基因組DNA。采用基因芯片法對(duì)ABCB1 C3435T、CYP2C19*2、 CYP2C19*3、 CYP2C19*17、 PON1 Q192R、CES1A2 A（-816）C、GAWS 位點(diǎn)：rs342293進(jìn)行基因檢測分型。

1.4.1 SNPs 特征（1）CYP2C19*2 是CYP2C19 基因第5 外顯子第681 位點(diǎn)堿基G→A 突變，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄時(shí)第5 外顯子初始段丟失40 個(gè)堿基對(duì)（634-682bp），翻譯時(shí)第227 個(gè)氨基酸位點(diǎn)產(chǎn)生異常的剪接位點(diǎn)，導(dǎo)致第215 到227 位點(diǎn)氨基酸缺失，產(chǎn)生一個(gè)僅有234 個(gè)氨基酸的截?cái)嗟牡鞍踪|(zhì)，該蛋白質(zhì)因缺少了血紅素結(jié)合功能區(qū)而喪失功能。（2）CYP2C19*3 是CYP2C19 基因第4 個(gè)外顯子堿基第636 位堿基G→A 突變，導(dǎo)致了提前產(chǎn)生的終止密碼子，使212 位色氨酸的密碼子變?yōu)榻K止密碼子，導(dǎo)致前4 個(gè)外顯子的編碼產(chǎn)物變成由211 個(gè)氨基酸組成但是沒有活性的蛋白質(zhì)。（3）CYP2C19*17是CYP2C19 基因上游5’側(cè)翼序列第-806 位堿基C→T 的突變，由于含有-806T→C 的調(diào)控元件可結(jié)合肝核蛋白，因此可加快CYP2C19 的轉(zhuǎn)錄速率，是CYP2C19 酶活性增加。（4）CES1A2 A（-816）C 是CES1 基因啟動(dòng)子區(qū)域第-816 位堿基A→C 突變可以提高該基因的轉(zhuǎn)錄效率，進(jìn)而提高該酶的表達(dá)活性。（5）ABCB1 基因位于7 號(hào)染色體p21-21.1，ABCB1 C3435T（rs1045642）是 第26 外 顯 子 堿基C→T 突變。（6）PON1 的基因定位于7 號(hào)染色體長臂q21.3～q22.1，長約25.9 kb，含9 個(gè)外顯子，8 個(gè)內(nèi)含子。PON1 Q192R（rs662）突變使得第192 位編碼區(qū)序列谷氨酰胺突變?yōu)榫彼帷?/p>

1.4.2 引物序列對(duì)7 個(gè)位點(diǎn)的序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)一代測序用的引物，PCR 擴(kuò)增后，產(chǎn)物進(jìn)行測序。設(shè)計(jì)7 個(gè)位點(diǎn)的Fluidigm 芯片引物，包括4 條引物，用于擴(kuò)增每個(gè)基因型位點(diǎn)的特異性引物ASP1 和ASP2，以及兩種基因型通用的上游和下游的預(yù)擴(kuò)引物STA 和LSP。見表1，其中F1 和R1 為外側(cè)引物，用于PCR 擴(kuò)增，F(xiàn)2 和R2 為內(nèi)側(cè)引物，用于測序。見表1。

表1 被檢測SNPs 的引物序列Tab.1 Primers for detection of SNPs

1.5 臨床數(shù)據(jù)收集收集入選患者的臨床資料、實(shí)驗(yàn)室資料及冠脈造影資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有的計(jì)量資料，符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，3 組間比較采用多個(gè)樣本均數(shù)比較的方差分析（ANOVA），2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布采用中位數(shù)和四分位數(shù)［M（Q25，Q75）］表示的統(tǒng)計(jì)量；3 組間比較釆用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，2 組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)（百分比）表示統(tǒng)計(jì)量，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本資料臨床及介入因素對(duì)血小板反應(yīng)指數(shù)的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 一般臨床因素及介入因素對(duì)血小板反應(yīng)指數(shù)的影響Tab.2 The influence of general clinical factors and interventional factors on platelet response index±s

表2 一般臨床因素及介入因素對(duì)血小板反應(yīng)指數(shù)的影響Tab.2 The influence of general clinical factors and interventional factors on platelet response index±s

變量年齡（歲）性別BMI（kg/cm2）疾病診斷病變冠脈病變支數(shù)植入支架個(gè)數(shù)類型≤44 歲45 ～59 歲60 ～74 歲75 ～85 歲男 女＜18.5 18.5 ≤BMI ＜24 24 ≤BMI ＜28≥28 STEMI UNSTEMI UA穩(wěn)定型心絞痛缺血性心肌病左前降支左回旋支右冠狀動(dòng)脈左主干1 2 ≥3 1 2 ≥3例數(shù)5 41 77 20 110 33 1 65 58 8 62 11 46 21 3 71 21 48 3 35 39 69 81 45 17血小板反應(yīng)指數(shù)（%）53.3±13.2 49.9±20.5 46.4±20.5 41.2±26.7 46.2±21.3 49.2±21.4 9.5±0.0 47.6±21.9 45.1±20.0 59.5±17.2 49.2±21.3 44.4±22.7 45.1±21.8 49.7±17.5 17.1±16.1 47.3±21.6 48.6±21.7 46.1±20.5 38.9±31.8 50.4±23.1 46.3±20.8 45.5±20.7 49.1±22.2 45.5±20.7 40.3±17.7 P 值0.490 0.479 0.089 0.111 0.213 0.630 0.261

2.2 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)本研究7 個(gè)SNPs 的最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）符合人類單倍體型圖計(jì)劃（Haplotype mapping-Chinese Han Beijing，HapMap-CHB）中國北京漢族人群的最小等位基因頻率。CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17、CES1A2A（-816）C、ABCB1 C3435T、PON1 Q192R、GWAS 位點(diǎn)經(jīng)χ2檢驗(yàn)，符合Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，說明本研究樣本具有良好的群體代表性。見表3。

表3 最小等位基因頻率及Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)Tab.3 Minimum allele frequency and Hardy-Weinberg equilibrium test

2.3 不同基因型對(duì)血小板反應(yīng)指數(shù)的影響根據(jù)基因分型結(jié)果，將CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17、PON1 Q192R、ABCB1 C3435T、CES1A2 A（-816）C、GAWS 位點(diǎn)：rs342293 分為野生型個(gè)體、突變雜合子和突變純合子；采用ANOVA 方差分析比較野生型，雜合子和突變純合子3組間VASP-流式細(xì)胞儀檢測的血小板反應(yīng)指數(shù)（PRI）之間差異。入選的143例患者全部完成基因分型，CYP2C19*1/*1 野生型個(gè)體59例（41.2%），CYP2C19*1/*2 突變雜合子67例（46.9%），CYP2C19*2/*2 突變純合子17例（11.9%）；CYP2C19*1/*1 野生型個(gè)體134例（93.7%），CYP2C19*1/*3 突變雜合子9例（6.3%），無突變純合子；CYP2C19*1/*1 野生型個(gè)體142例（99.3%），CYP2C19*1/*17 突變雜合子1例（6.7%），無突變純合子。ABCB1 C3435T 野生型個(gè)體51例（35.7%），雜合子70例（49.0%），純合子22例（15.3%）；CES1A2 A（-816）C 野生型個(gè)體71例（49.7%），雜合子63例（44.1%），純合子9例（6.2%）；PON1 Q192R 野生型個(gè)體65例（45.5%），雜合子62例（43.3%），純合子16例（11.2%）；GAWS 位點(diǎn)：rs342293 野生型個(gè)體85例（59.4%），雜合子49例（34.3%），純合子9例（6.3%）。其中，CYP2C19*2不同基因型對(duì)血小板反應(yīng)指數(shù)（PRI）有顯著影響，野生型個(gè)體（GG 型）PRI 平均值（41.6% ± 23.8%）最低，突變雜合子（AG 型）PRI 平均值（48.4% ±18.0%）次之，突變純合子（AA 型）PRI 平均值（59.5%±18.9%）最高。進(jìn)一步行CYP2C19*2 不同基因型內(nèi)的兩兩比較，野生型個(gè)體GG 型的PRI 值仍顯著低于突變純合子AA 型個(gè)體（P＝0.015）。見表4。

2.4 顯性模型（dominant model）及隱性模型（recessive model）血小板反應(yīng)指數(shù)影響在顯性模型分析中，CYP2C19*2 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，野生型個(gè)體PRI 均值為（45.2% ± 21.1%），突變等位基因攜帶者PRI 均值為（59.5% ± 18.9%），即說明突變等位基因攜帶者PRI 均值顯著高于野生型個(gè)體（P＝0.009），見表5。在隱性模型分析中，CYP2C19*2同樣差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，突變純合子PRI 值（50.6%± 18.6%），突變雜合子+野生型個(gè)體PRI 值（41.6% ± 23.8%），突變純合子顯著高于突變雜合子+野生型個(gè)體（P＝0.012）。見表6。

表4 不同基因型個(gè)體血小板反應(yīng)指數(shù)Tab.4 Platelet response index of individuals with different genotypes

3 討論

有研究［18］表明，盡管有雙重抗血小板治療，仍有相當(dāng)比例的患者表現(xiàn)出氯吡格雷抵抗，表現(xiàn)出嚴(yán)重的不良反應(yīng)及臨床結(jié)果。眾多研究［5-7］表明，不同個(gè)體對(duì)氯吡格雷的抗血小板反應(yīng)存在顯著差異，而這種差異發(fā)生機(jī)制目前尚未完全清楚。遺傳因素及非遺傳因素均可能導(dǎo)致氯吡格雷血小板反應(yīng)差異，遺傳因素是目前研究的熱點(diǎn)。本研究選取了143例明確診斷為冠心病，并行擇期PCI 或急診PCI 術(shù)的患者，所有患者均完成血小板反應(yīng)指數(shù)（PRI）及基因檢測，結(jié)果顯示CYP2C19*2 對(duì)血小板反應(yīng)指數(shù)（PRI）有顯著影響，野生型個(gè)體（GG型）PRI 平均值（41.6% ± 23.8%）最低，突變雜合子（AG 型）PRI 平均值（48.4% ± 18.0%）次之，突變純合子（AA 型）PRI 平均值（59.5% ± 18.9%）最高。進(jìn)一步行CYP2C19*2 不同基因型內(nèi)的兩兩比較，野生型個(gè)體GG 型的PRI 值仍顯著低于突變純合子AA 型個(gè)體（P＝0.015）。在顯示模型及隱性模型分析中，CYP2C19*2 同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而其他基因多態(tài)對(duì)PRI 值影響無顯著差異。

表5 顯性遺傳模型血小板反應(yīng)指數(shù)Tab.5 Platelet response index in dominant inheritance model±s

表5 顯性遺傳模型血小板反應(yīng)指數(shù)Tab.5 Platelet response index in dominant inheritance model±s

SNPs CYP2C19*2 CYP2C19*3 CYP2C19*17 CES1A2A（-816）C ABCB1 C3435T PON1 Q192R GWAS 位點(diǎn)基因型AA+AG GG AA+AG GG TT+CT CC CC+AC AA TT+CT CC AA+AG GG GG+GC CC血小板反應(yīng)指數(shù)PRI（%）59.5±18.9 45.2±21.1/46.9±21.3/46.9±21.3 36.1±25.0 47.6±20.9 40.0±19.1 48.2±21.5 51.3±21.5 46.3±21.3 41.1±21.8 47.3±21.3 P 值0.009/ /0.115 0.096 0.378 0.396

表6 不同基因多態(tài)對(duì)血小板反應(yīng)的隱性模型分析Tab.6 The recessive model analysis of different gene polymorphism on platelet reaction ±s

表6 不同基因多態(tài)對(duì)血小板反應(yīng)的隱性模型分析Tab.6 The recessive model analysis of different gene polymorphism on platelet reaction ±s

SNPs CYP2C19*2 CYP2C19*3 CYP2C19*17 CES1A2A（-816）C ABCB1 C3435T PON1 Q192R GWAS 位點(diǎn)基因型AA AG+GG AA AG+GG TT CT+CC CC AC+AA TT CT+CC AA AG+GG GG GC+CC血小板反應(yīng)指數(shù)PRI（%）50.6±18.6 41.6±23.8 57.3+19.2 46.2+21.3 62.2±0.0 46.8±21.3 47.6±20.8 46.2±21.9 47.2±20.0 46.4±23.6 47.2±21.6 46.5±21.1 47.3±1.3 41.1±21.8 P 值0.012 0.132 0.473 0.706 0.111 0.855 0.396

氯吡格雷是一種前體藥物，通過腸道吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，經(jīng)肝臟代謝成活性代謝物。其中約85%氯吡格雷經(jīng)羧酸酯酶代謝轉(zhuǎn)化生成無活性的羧酸代謝物；其余15%氯吡格雷在肝臟中通過細(xì)胞色素P450 同工酶（CYP450）代謝通過兩步走最終轉(zhuǎn)化生成有活性的巰基代謝物［19］。作為一種需要肝臟轉(zhuǎn)化為代謝物的藥物，氯吡格雷的反應(yīng)受到CYP2C19 的影響，CYP2C19 對(duì)氯吡格雷生物激活的兩種基本氧化步驟至關(guān)重要［20］。CYP2C19*2 是CYP2C19 基因第5 外顯子第681 位點(diǎn)堿基G→A 突變，導(dǎo)致mRNA 轉(zhuǎn)錄時(shí)第5 外顯子初始段丟失40個(gè)堿基對(duì)（634～682 bp），蛋白質(zhì)翻譯時(shí)第227 個(gè)氨基酸位點(diǎn)產(chǎn)生異常的剪接位點(diǎn)，導(dǎo)致第215 到227 位點(diǎn)氨基酸缺失，產(chǎn)生1 個(gè)僅有234 個(gè)氨基酸的截?cái)嗟牡鞍踪|(zhì)，該蛋白質(zhì)因缺少了血紅素結(jié)合功能區(qū)而喪失功能。CYP2C19*2 突變是氯吡格雷的慢代謝現(xiàn)象主要突變等位基因，其突變頻率在中國人為28%，墨西哥人7.9%、東亞人28.6%、南亞人29.8%、西亞及歐洲人12.4%、印度人37.5%。有研究發(fā)現(xiàn)，在接受氯吡格雷抗血小板治療的1 459例患者中，在CYP2C19 突變者中由于心血管病、心肌梗塞或中風(fēng)等引起的死亡事件的發(fā)生率12.1%，而野生型發(fā)生率為8.0%（攜帶者的HR＝1.53；95%CI：1.07～2.19），同時(shí)在1 389 位接受PCI的患者中，CYP2C19 突變者中發(fā)生確定的或可能形成支架血栓的患者為2.6%，而野生型為0.8%（HR＝3.09；95%CI：1.19～8.00）。由此推測，在接受氯吡咯雷治療的人群中，CYP2C19 基因突變者支架血栓形成（1 389例）和死亡風(fēng)險(xiǎn)（1 459例）均顯著高于非突變患者。此外，在健康受試者、急性冠脈綜合征患者、PCI 術(shù)患者中都發(fā)現(xiàn)，攜帶1 個(gè)或2 個(gè)CYP2C19 失功能等位基因（*2 或*3），氯吡格雷治療后殘余血小板活性顯著高于野生型個(gè)體（CYP2C19*1/*1）［16，21-23］。

本研究不足在于未證實(shí)CYP2C19 基因多態(tài)性和對(duì)氯吡格雷抵抗患者的不良結(jié)果之間的相關(guān)性，未來還需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)這一關(guān)聯(lián)。另外，非遺傳因素（臨床因素、合并用藥、實(shí)驗(yàn)室檢查等）對(duì)氯吡格雷的血小板反應(yīng)差異影響尚未明確，下一步可行相關(guān)研究，綜合考慮這些因構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可能有效發(fā)現(xiàn)高血小板反應(yīng)個(gè)體，準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)需要高危人群，優(yōu)化抗血小板的個(gè)體化治療策略，實(shí)施個(gè)體化治療。

綜上所述，rs4244285（CYP2C19*2）是冠心病PCI 術(shù)后患者氯吡格雷治療后血小板反應(yīng)差異的影響因素。本研究尚未觀察到ABCB1 C3435T、PON1 Q192R、GAWS 位 點(diǎn)：rs34229 及 CES、CYP2C19 上其他SNPs 對(duì)氯吡格雷血小板反應(yīng)差異的影響。CYP2C19 變異基因的基因測試可能為臨床醫(yī)生進(jìn)行個(gè)性化的抗血小板治療提供指導(dǎo)意見。