張明謙 鄧虹 李艷 陸爽 王媛 羅文娟 劉興園

昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科（昆明650051）

肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是造成肺癌患者預(yù)后不良的主要因素之一［1］，常發(fā)生于肺腺癌及小細(xì)胞肺癌［2］，一旦發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移將嚴(yán)重影響肺癌患者的臨床預(yù)后及生存時間，遺憾的是對已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的患者目前的臨床治療手段均無法有效抑制和治療［3］。究其原因是對肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未闡明，因此，深入開展對肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究對于降低肺癌病死率，改善臨床預(yù)后有重要意義。

人類LHX6（LIM homeobox domain 6）基因是編碼LIM 同源域的一類轉(zhuǎn)錄因子。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)LHX6 基因在肺癌中是一個受甲基化調(diào)控的基因，初步生物學(xué)功能研究發(fā)現(xiàn)該基因具有抑制肺癌細(xì)胞增殖和遷移的作用，是一個典型的抑癌基因［4］，進(jìn)一步利用公共數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)該基因與肺腺癌轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。因此，深入研究該基因抑制肺癌細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制，對于闡明該基因的生物學(xué)功能，探索新的肺癌防治思路尤為重要。

本研究采用體外實驗和體內(nèi)實驗相結(jié)合的方法，利用Western Bolt、Top/Fop、閃光實驗及熒光素酶報告實驗等方法對LHX6 基因抑制肺腺癌轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制進(jìn)行解析，并利用公共數(shù)據(jù)庫分析該基因表達(dá)水平可能的臨床意義，為進(jìn)一步深入開展研究LHX6 基因提供數(shù)據(jù)和資料。

1 材料與方法

1.1 肺癌細(xì)胞系、裸鼠及所需抗體實驗所需人類肺癌細(xì)胞株SPC-A-1、LTEP-A-2 和正常支氣管黏膜細(xì)胞HBE 細(xì)胞均購自中國科學(xué)院生命研究資源中心（上海）。所有的細(xì)胞都是在相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)（條件10%胎牛血清，溫度37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱）。

實驗所需BALB/C-裸鼠8 只（4 周齡，18～20 g購自中國第三軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心）安置在無菌環(huán)境下自由進(jìn)食。所有的動物護(hù)理和程序符合美國國立衛(wèi)生研究院的指導(dǎo)方針，動物所開展實驗符合動物倫理學(xué)規(guī)定。

實驗主要抗體包括anti-LHX6（1：1 000，購自Santa CruzBiotechnology），anti-CTNNB1（1：700，購自Santa CruzBiotechnology），anti-MMP7（1：1 000，購自Abcam），anti-c-Myc（1：1 000，購自Santa Cruz Biotechnology），anti-CCND1（1：1 000，購自Santa Cruz Biotechnology），anti-GAPDH（1：2 000，購自碧云天生物技術(shù)）。

1.2 實驗方法

1.2.1 公共數(shù)據(jù)庫分析LHX6 基因與肺腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性及可能的信號通路利用公共數(shù)據(jù)庫的肺癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)（http：//kmplot.com/analysis），系統(tǒng)分析LHX6 基因表達(dá)與患者預(yù)后之間的關(guān)系；利用（http：//www.cbioportal.org）公共數(shù)據(jù)庫分析LHX6基因表達(dá)與肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系；利用公共數(shù)據(jù)庫（https：//genomecancer.soe.ucsc.edu/）分 析LHX6 基因表達(dá)水平影響腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因表達(dá)情況。

1.2.2 裸鼠皮下成瘤實驗BALB/C-裸鼠8 只［4周齡，體質(zhì)量（18±1.9）g，雌雄比例1∶1］無菌環(huán)境下自由進(jìn)食飼養(yǎng)，隨機(jī)分為2 組（n＝4）。2 組小鼠分別在皮下注射空載體LTEP-A-2 細(xì)胞（8×106）及LHX6 過表達(dá)LTEP-A-2-LHX6 細(xì)胞（8 × 106），每周測量一次腫瘤體積（V＝1/2×A×B2，A 為長軸，B 為短軸），28 d 處死實驗小鼠，切除腫瘤并稱重，解剖小鼠觀察腫瘤轉(zhuǎn)移部位，小鼠肝臟切片及H&E 染色評估解剖觀察轉(zhuǎn)移情況。

1.2.3 細(xì)胞遷移和侵襲實驗（Transwell 實驗）采用24 孔8.0 μm Transwell 培養(yǎng)板，暗室上井注入空載體LTEP-A-2 細(xì)胞及LHX6 過表達(dá)LTEP-A-2-LHX6 細(xì)胞以及空載體SPC-A-1 細(xì)胞及LHX6 過表達(dá)SPC-A-1-LHX6 細(xì)胞（細(xì)胞注入量5 × 104/孔）及無血清培養(yǎng)基200 μL，暗室下井加入10%FBS 培養(yǎng)12 h（無基質(zhì)膠遷移實驗）及24 h（含基質(zhì)膠侵襲實驗），棉簽除膜后取出上井，甲醇固定后0.1%結(jié)晶紫染色，高倍鏡下隨機(jī)6 個視野細(xì)胞計數(shù)，觀察細(xì)胞遷移及侵襲能力，實驗重復(fù)3 次。

1.2.4 Top/Fop Flash 熒光素酶實驗根據(jù)LHX6基因啟動子序列設(shè)計引物后克隆該基因啟動子全長，克隆入熒光素酶表達(dá)載體（pGL3-Basic vector），將LHX6 基因啟動子熒光素酶載體、LHX6/Vector 和內(nèi)對照PRL-TK 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞SPC-A-1、LTEP-A-2。36 h 后收細(xì)胞后采用Promega 雙熒光素酶報告試劑盒（Dual Luciferase Kit）檢測熒光素酶活性的變化，確定LHX6 能夠抑制Wnt/βcatenin 信號通路的轉(zhuǎn)錄活性。

1.2.5 Wnt/β-catenin 下游基因蛋白及mRNA 表達(dá)水平將過表達(dá)和干擾LHX6 表達(dá)的細(xì)胞收集后，提取總RNA 和蛋白質(zhì)，采用RT-qPCR 和Western blot 檢測Cyclin D1、MMP7、c-Myc 表達(dá)水平變化，引物設(shè)計如下（表1）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法本實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較應(yīng)用Student′st檢驗或Mann-WhitneyU檢驗，Kaplan-Meier 生存曲線分析及Coxregression 回歸分析用于LHX6 基因表達(dá)與肺癌預(yù)后及轉(zhuǎn)移關(guān)系分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LHX6 基因與肺腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性及可能信號通路分析通過公共數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/analysis）分析LHX6 基因表達(dá)與臨床預(yù)后關(guān)系發(fā)現(xiàn)，肺腺癌中LHX6 表達(dá)與患者預(yù)后明顯正相關(guān)（圖1A，n＝720，P＝0.000 58）；而在肺鱗癌，LHX6表達(dá)與患者預(yù)后不相關(guān)（圖1A，n＝524，P＝0.14），通過表達(dá)譜數(shù)據(jù)（http：//www.cbioportal.org）分析發(fā)現(xiàn)LHX6 表達(dá)與肺癌轉(zhuǎn)移呈顯著負(fù)相關(guān)（圖1B，P＝0.015），通過影響腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn)（https：//genomecancer.soe.ucsc.edu/），LHX6 高表達(dá)與基因CD44 及基因MMP7 的低表達(dá)密切相關(guān)（圖1C），進(jìn)一步通過公共數(shù)據(jù)庫（TCGA https：//cancergenome.nih.gov/abouttcga/overview） 分析發(fā)現(xiàn)肺腺癌中LHX6 高表達(dá)與β-catenin 低表達(dá)相關(guān)，而在肺鱗癌中LHX6 表達(dá)與β-catenin 表達(dá)無關(guān)（圖1D）。

表1 實時定量基因擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)（qPCR）引物設(shè)計Tab.1 Design of primers for Real-time Quantitative PCR

圖1 LHX6 基因表達(dá)水平和不同類型肺癌患者預(yù)后、轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移關(guān)鍵基因表達(dá)水平相關(guān)性分析（公共數(shù)據(jù)庫分析）Fig.1 Analysis of the correlation between the expression level of LHX6 gene and the clinical outcome，metastasis and transfer key gene expression levels of patients with different types of lung cancer from public databases

2.2 裸鼠皮下成瘤實驗為確定LHX6 基因高表達(dá)后具有明顯的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，本研究通過裸鼠皮下成瘤實驗進(jìn)行驗證，結(jié)果表明LHX6 基因過表達(dá)后裸鼠腫瘤體積明顯減?。ū?、圖2A），同時通過對裸鼠肝臟切片觀察發(fā)現(xiàn)，LHX6 基因過表達(dá)后成瘤裸鼠肝臟轉(zhuǎn)移明顯減少（圖2B）。實驗數(shù)據(jù)表明LHX6 過表達(dá)后可以明顯抑制肺腺癌轉(zhuǎn)移發(fā)生。

2.3 細(xì)胞遷移和侵襲實驗（Transwell 實驗）進(jìn)一步通過細(xì)胞遷移和侵襲實驗（Transwell 實驗）確定LHX6 基因過表達(dá)后可以明顯抑制肺腺癌細(xì)胞遷移及侵襲能力，實驗結(jié)果顯示LHX6 基因過表達(dá)后肺腺癌細(xì)胞株SPC-A-1、LTEP-A-2 遷移及侵襲能力均明顯得到抑制（圖3）。

2.4 Top/Fop Flash 熒光素酶實驗及Wnt/βcatenin 下游基因蛋白及mRNA 表達(dá)水平檢測由于LHX6 基因是一轉(zhuǎn)錄因子，筆者推測其抑制肺腺癌轉(zhuǎn)移可能是通過與β-catenin 直接結(jié)合來調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)，為驗證這個假設(shè)，本研究進(jìn)行了熒光素酶報告實驗，數(shù)據(jù)顯示LHX6 基因過表達(dá)后顯著減弱了β-catenin 蛋白活性（圖4A），接下來對Wnt/β-catenin 下游基因蛋白及mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其下游基因Cyclin D1、MMP7、c-Myc 均出現(xiàn)了表達(dá)下降情況（圖4B 及圖4C），進(jìn)一步為了驗證過表達(dá)LHX6 可以抑制Wnt/β-catenin信號通路，本研究對β-catenin 蛋白及mRNA 水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)LHX6 后β-catenin 蛋白及mRNA 水平均顯著下調(diào)（圖5A 及圖5B）。實驗數(shù)據(jù)表明LHX6 基因抑制肺腺癌轉(zhuǎn)移是通過抑制及Wnt/β-catenin 信號通路來實現(xiàn)。

表2 裸鼠皮下成瘤實驗?zāi)[瘤生長情況Tab.2 Tumor growth in subcutaneous tumor formation in nude mice ±s，mm3

表2 裸鼠皮下成瘤實驗?zāi)[瘤生長情況Tab.2 Tumor growth in subcutaneous tumor formation in nude mice ±s，mm3

注：與第1 周相比，*P ＜0.05

組別LTEP-A-2-空載體（n=4）LTEP-A-2-LHX6（n=4）周數(shù)1 周10.5±2.3 11.2±1.7 2 周503.9±42.1*40.6±5.8*3 周1 239.0±156.7*471.7±99.2*4 周2 031.0±341.8*801.5±145.6*

圖2 裸鼠皮下成瘤實驗結(jié)果及肝臟轉(zhuǎn)移情況病理切片圖Fig.2 Results of subcutaneous tumor formation and liver metastasis in nude mice

圖3 過表達(dá)LHX6 基因?qū)Ψ蜗侔┘?xì)胞遷移及侵襲的影響Fig.3 Effect of overexpression of LHX6 gene on migration and invasion of lung adenocarcinoma cells

3 討論

肺腺癌是肺癌中常見的病理類型［5］，該疾病易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移是肺癌難以診治的根本原因之一，造成患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重及病死率高。如何有效地預(yù)防和抑制肺腺癌轉(zhuǎn)移是肺癌有效治療的關(guān)鍵因素之一。LHX6（LIM homeobox domain 6）基因是編碼LIM 同源域的一類轉(zhuǎn)錄因子［6］，前期研究發(fā)現(xiàn)LHX6 基因在肺癌中是一個受甲基化調(diào)控的基因且具有抑制肺癌細(xì)胞增殖和遷移的作用［4］，但其具體的抑制轉(zhuǎn)移機(jī)制尚未清楚，因此深入開展該基因抑制肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究將為有效治療肺癌提供新的思路。

圖4 Top/Fop Flash 熒光素酶實驗結(jié)果及Wnt/β-catenin 下游基因蛋白及mRNA 表達(dá)情況Fig.4 Top/Fop flash luciferase test and expression levels of Wnt/beta-catenin downstream gene protein and mRNA

圖5 LHX6 過表達(dá)抑制β-catenin 蛋白及mRNA 表達(dá)Fig.5 LHX6 inhibits the expression of β-catenin protein and mRNA

為明確LHX6 基因在不同肺癌類型中可能有著不同的臨床意義，本研究首先通過公共數(shù)據(jù)庫對該基因表達(dá)與不同的病理類型肺癌的預(yù)后進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LHX6 基因高表達(dá)可以明顯改善肺腺癌患者臨床預(yù)后，同時該基因與肺腺癌轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)且可以對引起轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因表達(dá)水平造成影響；為驗證LHX6 基因具有抑制肺腺癌轉(zhuǎn)移的生物學(xué)功能，本研究通過構(gòu)建裸鼠皮下成瘤實驗及LHX6 表達(dá)差異肺腺癌細(xì)胞株遷移及侵襲實驗進(jìn)行證實，數(shù)據(jù)顯示無論在體內(nèi)裸鼠皮下成瘤實驗還是體外肺腺癌細(xì)胞遷移及侵襲實驗，均明確顯示LHX6 基因過表達(dá)后可以明顯抑制肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；為進(jìn)一步探索該基因抑制肺腺癌轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制，筆者結(jié)合前期公共數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果和Top/Fop Flash 熒光素酶實驗結(jié)果，推測其抑制轉(zhuǎn)移機(jī)制可能為直接抑制Wnt/β-catenin 信號通路實現(xiàn)，為驗證推測，本研究對Wnt/β-catenin 通路下游基因Cyclin D1、MMP7、c-Myc表達(dá)水平進(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LHX6 基因過表達(dá)后Cyclin D1、MMP7、c-Myc均出現(xiàn)了不同程度的表達(dá)下降，最后本研究對βcatenin 蛋白和mRNA 表達(dá)情況進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示LHX6 基因過表達(dá)后可以明顯降低β-catenin 蛋白和mRNA表達(dá)水平，由于β-catenin是細(xì)胞粘附連接的重要成分［7］，也是Wnt 信號通路的調(diào)節(jié)中心［8］，所以筆者有理由認(rèn)為LHX 基因可以通過直接抑制Wnt/β-catenin 信號通路實現(xiàn)抑制肺腺癌轉(zhuǎn)移。誠然實驗條件和經(jīng)費限制，本研究未進(jìn)一步開展LHX6 基因與Wnt/β-catenin 信號通路結(jié)合位點及使用通道抑制劑后該基因表達(dá)情況等諸多問題研究，這也將是未來研究的重點之一。

綜上所述，LHX6 基因可以明顯抑制肺腺癌轉(zhuǎn)移，其抑制肺腺癌轉(zhuǎn)移是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路影響其下游基因轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)。