王瑤 馬駿 楊豐 張群輝 鐘俊達(dá)， 黃建玉 郭丹霞， 姜文才 徐琳

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院（廣州510403）；2中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科（廣州510010）；3南方醫(yī)科大學(xué)（廣州510515）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary heart disease，CHD）已成為危害人類健康的“頭號(hào)殺手”，最新數(shù)據(jù)表明CHD 病死率增長(zhǎng)迅猛，與10年前相比，城市增加1.63 倍，農(nóng)村增加3.98 倍。其中急性冠脈事件發(fā)病兇險(xiǎn)，嚴(yán)重威脅人們的生命［1］。研究［2-3］顯示，約70%的急性冠脈事件是由動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂引起的，易損斑塊是罪魁禍?zhǔn)祝?］。

力竭運(yùn)動(dòng)是疲勞長(zhǎng)期積累而引起機(jī)體功能紊亂的病理狀態(tài)。力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體血液中的兒茶酚胺水平升高，心臟負(fù)荷加重，同時(shí)機(jī)體水分蒸發(fā)快、血液黏稠度增高、血管內(nèi)皮損傷，易出現(xiàn)血小板聚集和血栓形成，引起心肌嚴(yán)重缺血，甚至導(dǎo)致猝死［5-6］。然而力竭運(yùn)動(dòng)是否直接誘導(dǎo)易損斑塊破裂還未得到證實(shí)。

CHD 是內(nèi)外因共同作用的復(fù)雜過(guò)程，離不開(kāi)長(zhǎng)期慢性炎癥累積，抗阻運(yùn)動(dòng)在CHD 防治方面已被證實(shí)有一定成效，研究［7-8］表明抗阻運(yùn)動(dòng)可增加骨骼肌質(zhì)量和力量，提高基礎(chǔ)代謝率，加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)耐力，通過(guò)降低血清炎癥因子水平改善機(jī)體的慢性炎癥狀態(tài)。但抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)易損斑塊的影響尚不知曉。本研究探討力竭游泳運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)易損斑塊破裂，抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)易損斑塊穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡SPF級(jí)C57BL/6J背景ApoE-/-雄性小鼠30 只，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，許可證號(hào)SCXK（蘇）2015-0001，飼養(yǎng)于南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院（原廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫22～24 ℃，相對(duì)濕度50%，光照時(shí)間7：00～19：00，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，高脂飲食（主要成分0.15%膽固醇、21%脂肪和15.5%蛋白質(zhì)），購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型全部ApoE-/-雄性小鼠適應(yīng)性高脂喂養(yǎng)1 周后行左側(cè)頸總動(dòng)脈套管術(shù)，腹腔麻醉（3%戊巴比妥，2 mL/kg），于氣管旁找到左側(cè)頸總動(dòng)脈，小心分離，套入硅膠管，實(shí)驗(yàn)全程高脂飲食飼養(yǎng)。

1.2.2 力竭運(yùn)動(dòng)的實(shí)施力竭游泳運(yùn)動(dòng)采用水迷宮作為小鼠游泳槽，內(nèi)壁光滑，水溫控制在（32 ±2）℃之間，室溫控制在21～23 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，水深為小鼠（身長(zhǎng)+尾長(zhǎng)）×1.5 倍，小鼠尾部負(fù)重2%的體質(zhì)量負(fù)荷。正式實(shí)驗(yàn)前1 天進(jìn)行1 次熱身運(yùn)動(dòng)以適應(yīng)游泳。

力竭標(biāo)準(zhǔn)：小鼠連續(xù)3 次沉入水底，每次超過(guò)5 s，不能自主浮上水面；同時(shí)觀察小鼠身體狀況，當(dāng)出現(xiàn)協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)喪失，放在平面上無(wú)法完成翻正反射時(shí)即從水中撈出。每次游泳運(yùn)動(dòng)結(jié)束后均擦除水分，并使用吹風(fēng)機(jī)吹干皮毛。每次游泳至力竭標(biāo)準(zhǔn)。力竭游泳運(yùn)動(dòng)共進(jìn)行14 d，1 次/d，于最后1 次力竭游泳運(yùn)動(dòng)后即刻取材。

1.2.3 抗阻運(yùn)動(dòng)的實(shí)施參考過(guò)往文獻(xiàn)報(bào)道［9，12］的方法，ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈套管術(shù)后于第10 周齡開(kāi)始進(jìn)行7 d 漸進(jìn)性遞增負(fù)荷的爬梯訓(xùn)練。爬梯高為1.1 m，間隔為2 cm，傾斜角度為85°。第一周為適應(yīng)性訓(xùn)練，以不負(fù)重起始，每天以10%體質(zhì)量的負(fù)荷遞增（負(fù)荷使用橡皮泥綁在小鼠尾巴根部），終負(fù)荷為體質(zhì)量的70%，每天進(jìn)行兩組，每組重復(fù)3 次，組內(nèi)休息1 min，組間休息2 min，5 d/周，持續(xù)8 周。

1.2.4 動(dòng)物分組及處理將ApoE-/-小鼠稱重后，小鼠的體質(zhì)量為（22.93± 1.26）g，隨機(jī)分為對(duì)照組（Ctl 組）、力竭組（Exh 組）、抗阻+力竭組（Res+Exh組），分組完成后，打耳標(biāo)，Ctl 組編號(hào)1、2、3、4……；Exh 組11、12、13、14……；Res+Exh 組21、22、23、24、25……。全程高脂喂養(yǎng)，全部小鼠行頸總動(dòng)脈套管術(shù)，Ctl 組正常活動(dòng)10 周，術(shù)后Exh 組先正?；顒?dòng)8 周再進(jìn)行2 周力竭游泳運(yùn)動(dòng)，Res+Exh 組先進(jìn)行8 周抗阻運(yùn)動(dòng)再進(jìn)行2 周力竭游泳運(yùn)動(dòng)。結(jié)束后取血，標(biāo)本離心取上清；冰生理鹽水、4%多聚甲醛心臟灌流取出頸總動(dòng)脈，4%多聚甲醛固定，分別石蠟包埋和冰凍切片。頸總動(dòng)脈段剪下，生理鹽水清洗，迅速置液氮速凍，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

1.3 組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)從石蠟包埋的頸總動(dòng)脈根部起始制成5 μm 厚度連續(xù)切片，行HE 染色觀察斑塊大小及纖維帽厚度、Masson 染色觀察膠原成分。冰凍切片上行油紅O 染色觀察脂質(zhì)沉積，免疫組化檢測(cè)巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞在局部的表達(dá)。光學(xué)顯微鏡下觀察其病理形態(tài)。利用IPP 圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算斑塊面積大小、纖維帽厚度和易損指數(shù)［易損指數(shù)=（巨噬細(xì)胞+脂質(zhì)）面積陽(yáng)性%/（平滑肌細(xì)胞+膠原）面積陽(yáng)性%］。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）用ELISA 試劑盒檢測(cè)血清血脂水平總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)采用SPSS 21.0（IBM 公司，美國(guó)）和GraphPad Prism 7 統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以表示，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示。K-S 檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性分析，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，3 組組間比較比較用方差分析，兩兩比較用SNK 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠實(shí)施力竭運(yùn)動(dòng)和抗阻運(yùn)動(dòng)與Ctl 組相比，體質(zhì)量、血脂水平、病理免疫組化檢測(cè)指標(biāo)的變化情況實(shí)驗(yàn)后3 組的體質(zhì)量均上升，其中Res+Exh 組上升幅度最??；血脂水平抗阻運(yùn)動(dòng)得到改善；病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)斑塊破裂影響最大，而抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)其有減少作用。見(jiàn)表1。

抗阻運(yùn)動(dòng)和力竭游泳運(yùn)動(dòng)開(kāi)始前，3 組小鼠的體質(zhì)量均為（22.93 ± 1.26）g，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。高脂飲食后3組體質(zhì)量均上升，Ctl組（27.46±1.59）g上升最明顯，Res+Exh組（25.74 ± 0.75）g 上 升 幅 度 小 于Exh 組（27.46 ±1.59）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 頸總動(dòng)脈斑塊面積大小、纖維帽厚度、脂質(zhì)沉積、膠原成分的比較頸動(dòng)脈石蠟切片HE 染色病理結(jié)果顯示，Ctl 組無(wú)斑塊形成，Exh 組斑塊面積最大。見(jiàn)圖1。

斑塊大小、纖維帽厚度、脂質(zhì)沉積和膠原成分3 組比較，斑塊大小Ctl 組（131.12 ± 2.91）μm2，Exh組（178.94 ± 3.74）μm2，Res+Exh 組（94.84 ± 3.74）μm2，Exh 組斑 塊 面積大于Ctl 組和Res+Exh 組，Res+Exh 組最小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。Exh 組纖維帽厚度（1.31 ± 0.04）μm 比Ctl 組（3.07± 0.12）μm 和Res+Exh 組（5.65 ± 0.25）μm 薄，Res+Exh 組的纖維帽最厚（P＜0.05）。Exh 組（57.56 ±1.12）%膠原 成分 少 于Ctl 組（65.47 ± 0.69）%和Res+Exh 組（69.57 ± 0.64）%，脂 質(zhì) 沉 積Exh 組（17.29 ± 1.2）%大于Ctl 組（15.37 ± 1.59）%和Res+Exh 組（13.01±0.97）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3 組體質(zhì)量、病理指標(biāo)、血脂水平情況Tab.1 Three groups of body mass，pathological indicators，blood lipid levels ±s

表1 3 組體質(zhì)量、病理指標(biāo)、血脂水平情況Tab.1 Three groups of body mass，pathological indicators，blood lipid levels ±s

注：與Ctl 組相比，*P ＜0.05

指標(biāo)體質(zhì)量（g）實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)后斑塊面積（10 μm2）纖維帽厚度（μm）脂質(zhì)沉積（%）膠原成分（%）血管平滑肌細(xì)胞（%）巨噬細(xì)胞（%）易損指數(shù)（%）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）Ctl 組（n=10）23.32±1.45 27.46±1.59 131.12±2.91 3.07±0.12 15.37±1.59 65.47±0.69 6.07±0.27 1.48±0.23 0.24±0.02 16.91±0.25 1.14±0.47 18.94±2.64 5.54±0.53 Exh 組（n=10）22.72±1.31 27.46±1.59*178.94±3.74*1.31±0.04*17.29±1.25*57.56±1.12*4.44±0.33*2.68±0.51*0.32±0.02*16.97±0.22*1.15±0.44*18.91±2.56*5.47±0.48*Res+Exh 組（n=10）22.75±1.03 25.74±0.75*94.84±3.74*5.65±0.25*13.01±0.97*69.57±0.64*6.63±0.24*1.90±0.23*0.20±0.01*15.69±0.63*0.89±0.40*16.43±3.08*5.99±0.56*

2.3 頸總動(dòng)脈斑塊局部巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的表達(dá)Exh 組巨噬細(xì)胞表達(dá)率（2.68 ± 0.51）%高于Ctl 組（1.48±0.23）%和Res+Exh 組（1.90±0.23）%，相反，SMC Exh 組（4.44 ± 0.33）%最少，Ctl 組（6.07± 0.27）%比Res+Exh 組（6.63 ± 0.24）%少（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 各組易損指數(shù)的比較Exh 組（0.32±0.02）%易損指數(shù)明顯高于Ctl 組（0.24 ± 0.02）%和Res+Exh 組（0.20±0.01）%，Res+Exh 組高于Ctl 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.5 3 組血清血脂指標(biāo)的比較3 組血清TG、TC、LDL-C 、HDL-C 水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ctl組血脂水平高于Exh 組和Res+Exh 組（P＜0.05），Res+Exh 組最低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的病理基礎(chǔ)，易損斑塊破裂則是引起急性冠脈事件的元兇。力竭狀態(tài)是指動(dòng)物或人進(jìn)行運(yùn)動(dòng)時(shí)，直到完全不能運(yùn)動(dòng)為止的現(xiàn)象，是疲勞長(zhǎng)期積累而引起機(jī)體功能紊亂的病理狀態(tài)，在進(jìn)行緊張激烈的運(yùn)動(dòng)時(shí)，血液中的兒茶酚胺水平升高，心肌需氧量增加，心臟負(fù)荷加重，同時(shí)機(jī)體水分蒸發(fā)快，血液黏稠度增高、血管內(nèi)皮損傷，易出現(xiàn)血小板聚集和血栓形成，引起心肌嚴(yán)重缺血，導(dǎo)致猝死［6，13］。BECK 等［14］研究證實(shí)，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)也會(huì)引起一系列炎癥反應(yīng)，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，從而導(dǎo)致機(jī)體各種疾病和損傷的發(fā)生。在消耗性體力活動(dòng)期間，急性心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)暫時(shí)增加，在12 461例急性心肌梗死的患者中，在梗塞發(fā)作時(shí)有13.6%的病例處于體力活動(dòng)，這點(diǎn)也提示力竭運(yùn)動(dòng)狀態(tài)可能成為急性心肌梗死的誘因［13，15］。本研究發(fā)現(xiàn)Exh 組與Ctl 組和Res+Exh 組相比，斑塊面積大于Ctl 組和Res+Exh 組，纖維帽厚度最薄，易損指數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Ctl 組（P＜0.05），說(shuō)明力竭運(yùn)動(dòng)可能誘導(dǎo)易損斑塊破裂，增加斑塊的不穩(wěn)定性。

圖1 3 組石蠟切片HE 染色病理結(jié)果Fig.1 Pathological results of HE staining of paraffin sections in three groups

圖2 力竭運(yùn)動(dòng)和抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)易損指數(shù)的影響Fig.2 Effects of exhaustive and resistive exercises on the vulnerability index

已有研究報(bào)道抗阻運(yùn)動(dòng)使CHD 患者獲益，增加骨骼肌質(zhì)量和力量，提高基礎(chǔ)代謝率，加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)耐力［7-8］，改善胰島素抵抗［11］。研究發(fā)現(xiàn)3 個(gè)月的有氧結(jié)合抵抗運(yùn)動(dòng)明顯降低補(bǔ)體C1q/腫瘤壞子因子相關(guān)蛋白水平，抗阻運(yùn)動(dòng)在改善機(jī)體炎癥水平方面優(yōu)于有氧運(yùn)動(dòng)，可以通過(guò)降低機(jī)體血清炎癥因子水平改善肥胖機(jī)體的慢性炎癥狀態(tài)。李良等［9-10］研究表明8 周有氧運(yùn)動(dòng)或抗阻運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練通過(guò)提高大鼠肝臟FGF21 的蛋白表達(dá)水平促進(jìn)了脂質(zhì)代謝并在一定程度上減輕了肥胖大鼠的體質(zhì)量，改善了血脂水平。研究［16-17］表明急性冠脈綜合征患者心臟康復(fù)有氧運(yùn)動(dòng)后體質(zhì)量減輕，肥胖BMI和腹圍的管理與靶器官損害和預(yù)后有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示抗阻運(yùn)動(dòng)干預(yù)組體質(zhì)量上升幅度較小，血脂水平低，可能與其調(diào)整血脂代謝，增加瘦體質(zhì)量有關(guān)，這與上述研究具有一致性。葉城潔等［18］研究發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動(dòng)可以增加乙酰輔酶A 羧化酶的磷酸化水平，激活與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因，分解脂肪酸，降低血脂。而張娜等［19］發(fā)現(xiàn)力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致小鼠脂質(zhì)代謝紊亂，血清總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C）水平顯著升高，而甘油三酯（TG）水平顯著降低。ANTHONY 等［20］研究顯示1年抗阻運(yùn)動(dòng)改善老年人血脂譜和降低乳糜微粒濃度。這與陳亞麗［21］抗阻訓(xùn)練有效改善老年超重及肥胖女性的慢性炎癥狀態(tài)及降低血脂結(jié)果一致?？棺柽\(yùn)動(dòng)干預(yù)組的斑塊面積最小、纖維帽厚度最大，易損指數(shù)最小說(shuō)明其可能有穩(wěn)定斑塊的作用，究其原因可能與血脂水平改善有關(guān)。本研究結(jié)果顯示Exh 組的血脂水平高于Res+Exh 組，這與張娜等研究結(jié)果力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致小鼠脂質(zhì)代謝紊亂相吻合，同時(shí)說(shuō)明抗阻運(yùn)動(dòng)降低血脂水平。

巨噬細(xì)胞在促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，活化的巨噬細(xì)胞吞噬LDL-C 形成泡沫細(xì)胞，聚集在斑塊的纖維帽中，使斑塊穩(wěn)定性變?nèi)?，容易破裂?2-24］。巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和平滑肌細(xì)胞凋亡是斑塊失穩(wěn)的標(biāo)志，本研究結(jié)果顯示小鼠進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)后，頸動(dòng)脈斑塊局部巨噬細(xì)胞的表達(dá)比力竭運(yùn)動(dòng)組少，平滑肌細(xì)胞的表達(dá)多于Exh組。抗阻運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和平滑肌細(xì)胞凋亡從而起到穩(wěn)定斑塊的作用。

綜上所述，力竭運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣易損斑塊破裂，抗阻運(yùn)動(dòng)可能起到穩(wěn)定斑塊的作用，可能與改善血脂水平、抑制巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和平滑肌凋亡有關(guān)，其機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。