賈福懷，韓曉峰，王 俊*，涂宏建，熊菲菲，陳 磊

(1.寧波御坊堂生物科技有限公司，浙江 寧波 315012；2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司功能主食創(chuàng)制與慢病營(yíng)養(yǎng)干預(yù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100015)

隨著時(shí)代發(fā)展的加快，現(xiàn)代人的生活水平逐步提高，人們對(duì)食品的消費(fèi)觀念也發(fā)生了變化，尤其是飲食越來(lái)越精細(xì)，所攝入的食物中粗纖維的含量越來(lái)越少，日常飲食難以提供足夠的膳食纖維，并且每天攝入了過(guò)多的糖分和油脂，給身體造成沉重負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致易疲勞以及糖脂代謝異常，使人體失去膳食營(yíng)養(yǎng)平衡，從而帶來(lái)肥胖、便秘、心血管疾病、高膽固醇、糖尿病等一系列問(wèn)題，影響人們的身體健康。

膳食纖維被稱為第七類營(yíng)養(yǎng)素，是被公認(rèn)的一種非常重要的功能性食品原料，在人體中發(fā)揮著重要作用。根據(jù)來(lái)源不同，可分為天然植物組成來(lái)源的膳食纖維；通過(guò)物理、化學(xué)、酶的方法從植物中提取獲得的膳食纖維；合成的膳食纖維[1]。根據(jù)水溶性的不同，分為可溶性膳食纖維和非水溶性膳食纖維，非水溶性食物纖維包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，是植物細(xì)胞壁的組成部分，來(lái)源于禾谷和豆類種子的外皮，以及植物的莖和葉；可溶性食物纖維包括果膠、藻膠、豆膠、樹(shù)膠、粘質(zhì)及一些種類的半纖維素[2]。

膳食纖維有很高的持水性，具有很強(qiáng)的吸附性，在化學(xué)組成上有多個(gè)碳水化合物聚合物的大分子，結(jié)構(gòu)中含有羧基、羥基、氨基、醛酮基等許多親水基團(tuán)[3]，可以吸附和螯合膽固醇、膽汁酸以及腸道內(nèi)的內(nèi)源性毒素、重金屬等物質(zhì)[4]；可產(chǎn)生離子交換能力，對(duì)陽(yáng)離子具有交換作用；可在代謝過(guò)程中影響消化道的pH值、滲透壓以及氧化還原電位等，能形成一個(gè)緩沖的環(huán)境，以利于消化吸收[5]；還能促進(jìn)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)，起到平衡腸道菌群的作用[6]；能影響糖代謝，有利于降低糖尿病的發(fā)病率[7]，具有降血糖、降膽固醇的作用；可以降低患直腸癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)[8]；還具有改善口腔、調(diào)節(jié)體重、影響礦物質(zhì)吸收、調(diào)節(jié)免疫等生理功能。

基于膳食纖維的特點(diǎn)和生理功能，針對(duì)膳食纖維攝入不足的城市人群研制的復(fù)合膳食纖維粉原料天然、安全可靠，可降低血脂，具有保護(hù)肝臟和心腦血管的功效，迎合了人們對(duì)天然、去油、減重、保護(hù)腸道健康的訴求。本研究對(duì)復(fù)合膳食纖維粉的配方進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)HepG2細(xì)胞脂肪變性模型試驗(yàn)[9]，對(duì)復(fù)合膳食纖維調(diào)節(jié)脂代謝的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與儀器

1.1 材料

圓苞車(chē)前子殼(上海諾申貿(mào)易有限公司)；魔芋(湖北一致魔芋有限公司)；山楂果(承德福生元農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司)；紅曲米(武漢佳成生物制品有限公司)；葛根(青島隆海食品有限公司)；玉米低聚肽(浙江海氏生物科技有限公司)；聚葡萄糖(河南泰利杰生物科技有限公司)；檸檬酸(濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司)；三氯蔗糖(鹽城捷康三氯蔗糖制造有限公司)；二氧化硅(安徽山河藥用輔料股份有限公司)；紫甘薯、桑葚(農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采購(gòu))。

1.2 主要設(shè)備與儀器

BT-9300LD激光粒度分布儀、BT-1001智能粉體特性測(cè)試儀(丹東百特儀器有限公司)；DFY-500高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(上海新諾儀器設(shè)備有限公司)；YC-15試驗(yàn)型噴霧干燥機(jī)(上海雅程儀器設(shè)備有限公司)；R-1020旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；LXJ-IIB低速大容量多管離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；DHG-9240A鼓風(fēng)干燥烘箱、BPZ-6093LCB真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SYH-15三維運(yùn)動(dòng)混合機(jī)(常州市星干干燥設(shè)備有限公司)；LHS16-A烘干法水分測(cè)定儀(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)；ME3002E電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；微量移液槍(德國(guó)Eppendorf公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器有限公司)；生物安全柜(中國(guó)濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)；37 ℃ CO2培養(yǎng)箱(日本松下公司)；pH計(jì)、精密電子天平CP214(瑞士Mettler Toledo公司)；759-紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)；DK-8D三溫三控水槽(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHA-B水浴恒溫振蕩器(金壇市精達(dá)儀器制造廠)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)熱電集團(tuán))；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)。

1.3 試劑

磷酸緩沖鹽溶液(phosphate bufferedsaline，PBS)、油酸(oleic acid，OA)、棕櫚酸(palmitic acid，PA)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、胰蛋白酶、油紅O染色劑，購(gòu)自美國(guó)Sigma化學(xué)公司；DMEM培養(yǎng)基、噻唑蘭(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenylterazoliumbromide，MTT)，購(gòu)自太和華美(北京)醫(yī)藥科技股份有限公司；無(wú)FFA牛血清蛋白(FFAfreebovine serum albumin，BSA)，購(gòu)自日本W(wǎng)AKO公司；RIPA細(xì)胞裂解液，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；甘油三脂(triglycerol，TG)試劑盒，購(gòu)自南京建成泰浩生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、氫氧化鉀，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；6孔板，購(gòu)自Nest Biotech China。

2 方法

2.1 復(fù)合膳食纖維粉制備工藝

2.1.1 制備工藝流程 見(jiàn)圖1。

圖1 工藝流程

2.1.2 原料制備 (1)粉碎原料。圓苞車(chē)前子殼粉制備：選擇人工種植的圓苞車(chē)前種子外殼為原料，經(jīng)挑選、除雜，碾磨、粉碎，過(guò)100目篩后制得。葛根粉制備：取粉葛根根莖，經(jīng)清洗、切片、烘干、粉碎、篩分制得。紅曲米粉制備：為市售發(fā)酵好的紅曲米，經(jīng)研磨、粉碎后制得。

(2)提取原料。魔芋粉制備：選擇鮮魔芋，經(jīng)清洗，去皮，切塊，粉碎，食用酒精浸泡洗滌，過(guò)濾固液分離，得濕魔芋精粉粒子，經(jīng)反復(fù)多次食用酒精洗滌脫水，真空干燥(70 ℃)、閃蒸干燥(90 ℃)至水分含量小于7%，除雜、100目篩分后制得。山楂果粉制備：取鮮山楂果，經(jīng)挑選，清洗，除雜，打漿，均質(zhì)，噴霧干燥，篩分后制得。紫甘薯粉制備：取紫甘薯塊莖，經(jīng)清洗，挑選，榨汁，過(guò)濾，濃縮(相對(duì)密度1.06～1.08)，噴霧干燥、篩分后制得。

桑葚粉制備：取鮮桑葚果，經(jīng)清洗、挑選、榨汁、過(guò)濾、濃縮(相對(duì)密度1.08～1.10)、噴霧干燥、篩分后制得。

2.2 感官評(píng)價(jià)方法

評(píng)價(jià)小組篩選10人，由具有食品相關(guān)背景的人員組成，按照6 g產(chǎn)品加入250 mL溫水的比例進(jìn)行沖泡，從產(chǎn)品的色澤、氣味、口感、組織狀態(tài)四個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.3 單因素試驗(yàn)

復(fù)合膳食纖維粉產(chǎn)品配方以圓苞車(chē)前子殼粉、山楂果粉、聚葡萄、葛根粉、紫甘薯粉、桑葚粉、玉米低聚肽(食用量<4.5 g/天)為基礎(chǔ)，按照感官評(píng)價(jià)方法評(píng)分為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)的方法，每次只改變配方中單一原料的添加比例，其他原料添加比例不變，分別考察不同原料的比例對(duì)產(chǎn)品感官質(zhì)量的影響，確定基礎(chǔ)配方。

2.4 粒徑和流動(dòng)性分析

物料粉末的狀態(tài)和粒徑對(duì)產(chǎn)品流動(dòng)性和混合均勻工藝具有較大影響，關(guān)系到產(chǎn)品裝量的穩(wěn)定性和一致性。筆者利用激光粒徑儀和智能粉體特性測(cè)試儀，對(duì)原料的粒徑和流動(dòng)性進(jìn)行分析。試驗(yàn)以二氧化硅添加量為單因素試驗(yàn)，對(duì)混合后的物料進(jìn)行休止角、崩潰角、差角、平板角、松裝密度、振實(shí)密度、壓縮度、均齊度、流動(dòng)性指數(shù)測(cè)定研究。

2.5 正交試驗(yàn)篩選優(yōu)化風(fēng)味、色澤物質(zhì)比例

在單因素基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)正交試驗(yàn)，考察魔芋粉、紅曲米粉、檸檬酸、三氯蔗糖對(duì)產(chǎn)品的氣味、色澤、口感和組織狀態(tài)的影響，篩選出最優(yōu)組合比例。

2.6 膳食纖維含量測(cè)定

采用國(guó)標(biāo)GB5009.88《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中膳食纖維的測(cè)定》的方法進(jìn)行復(fù)合膳食纖維粉的測(cè)定。

2.7 脂代謝功能評(píng)價(jià)

采用游離混合脂肪酸(FFA)(V油酸∶V棕櫚酸=2∶1)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂肪變性細(xì)胞模型方法實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)復(fù)合膳食纖維粉對(duì)脂代謝的調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié)果與分析

3.1 基礎(chǔ)原料配比

通過(guò)前期的單因素試驗(yàn)研究，確定復(fù)合膳食纖維粉配方中基礎(chǔ)原料添加比例：28%山楂果粉，25%圓苞車(chē)前子殼粉，25%聚葡萄糖，6%葛根粉，3.6%玉米低聚肽，2%紫甘薯粉，1.8%桑葚粉。

3.2 原料粒徑分析

利用激光粒度分析儀對(duì)11種原料進(jìn)行粒度分布的測(cè)定，并依據(jù)粒度分布進(jìn)行平均粒徑的計(jì)算，11種單一原料粒度分布結(jié)果及平均粒徑見(jiàn)表2，原料平均粒徑見(jiàn)圖2。由原料體積平均粒徑對(duì)比分析可知，復(fù)合膳食纖維粉的11種原料平均粒徑差異不大，各物料之間通過(guò)三維運(yùn)動(dòng)混合機(jī)易混合均勻。

表2 膳食纖維粉原料粒徑分析結(jié)果

圖2 復(fù)合膳食纖維原料平均粒徑比較

3.3 二氧化硅對(duì)成品流動(dòng)性分析

利用BT-1001智能粉體特性測(cè)試儀，對(duì)混合后的物料進(jìn)行休止角、崩潰角、差角、平板角、松裝密度、振實(shí)密度、壓縮度、均齊度、流動(dòng)性指數(shù)測(cè)定研究，對(duì)添加不同比例二氧化硅后的物料進(jìn)行整體流動(dòng)性評(píng)價(jià)，其流動(dòng)性分析評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 流動(dòng)性分析評(píng)價(jià)結(jié)果

由表3結(jié)果可以看出，添加二氧化硅比例為0.4%，成品粉體流動(dòng)性指數(shù)最高，流動(dòng)性評(píng)價(jià)為相當(dāng)良好，作為本品助流劑添加量，有助于改善產(chǎn)品流動(dòng)性，便于產(chǎn)品包裝。

3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化配方

以魔芋粉、紅曲米粉、檸檬酸、三氯蔗糖作為4因素，各取3水平，采用L9(34)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以感官評(píng)分為考察指標(biāo)，正交試驗(yàn)的因素水平如表4所示，試驗(yàn)及結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表5結(jié)果可知，第6組評(píng)分最高，水平組合為A2B3C1D2；從K值分析中也是組合A2B3C1D2評(píng)分最高。綜上得出復(fù)合膳食纖維粉最佳比例為A2B3C1D2，即檸檬酸3.2%，紅曲米粉1.6%，魔芋粉3.0%，三氯蔗糖0.4%。

3.5 復(fù)合膳食纖維粉中膳食纖維含量測(cè)定

采用GB5009.88《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膳食纖維的測(cè)定》的檢測(cè)方法，對(duì)不同批次復(fù)合膳食纖維粉進(jìn)行膳食纖維含量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 復(fù)合膳食纖維粉膳食纖維含量

3.6 復(fù)合膳食纖維粉脂代謝功能評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)采用游離混合脂肪酸(FFA)(V油酸∶V棕櫚酸=2∶1)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂肪變性細(xì)胞模型方法實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)復(fù)合膳食纖維粉對(duì)脂代謝的調(diào)節(jié)作用。給予含不同濃度的復(fù)合膳食纖維粉的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性，篩選受試物的最佳作用濃度。

3.6.1 HepG2細(xì)胞脂肪變性模型甘油三酯(TG)代謝評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

3.6.1.1 測(cè)試樣品功能成分提取 稱取20 g復(fù)合膳食纖維樣品，倒入250 mL錐形瓶中，加入100 mL75%酒精充分?jǐn)嚢?，超聲攝取15 min，靜置分層后，上清液濾；共提取3次，直到提取液顏色變淡；合并濾液，減壓蒸除溶劑；剩余黏稠狀物質(zhì)經(jīng)冷凍干燥24 h，得到深紅色固體粉末。

3.6.1.2 測(cè)試樣品濃度篩選MTT實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)良好、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，PBS洗3次，胰酶消化后進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為105個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔200 μL，置于5% CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)上清液，PBS洗去未貼壁細(xì)胞，分別加入100 μL DMEM培養(yǎng)基和不同待測(cè)樣品(25～1 000 μg/mL)。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于5% CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，換成100 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，每孔加50 μL MTT(2 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩儀振蕩10 min后，使用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm下的各孔OD值。獨(dú)立批次細(xì)胞試驗(yàn)重復(fù)3次。

根據(jù)測(cè)得的OD值計(jì)算各組細(xì)胞的活力占比，由圖3所示，與正常細(xì)胞Control組相比，25～1 000 μg/mL各濃度組中，只有1 000 μg/mL表現(xiàn)出顯著性差異，即25～500 μg/mL為合適的濃度考察范圍。

圖3 MTT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果

3.6.2 脂肪變性模型甘油三酯(TG)代謝評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

3.6.2.1 FFA(油酸∶棕櫚酸=2∶1的混合物)配制 稱取一定量BSA，溶于無(wú)糖無(wú)酚紅不完全DMEM培養(yǎng)基中，用10 mol/L的KOH調(diào)pH=10，超聲至澄清。稱取一定量的油酸和棕櫚酸，溶于少量含BSA相應(yīng)不完全培養(yǎng)基中，使得FFA溶液中油酸與棕櫚酸的摩爾比例為2∶1，同時(shí)FFA與BSA的摩爾比例為6.6∶1(即1 mM FFA∶1% BSA)，超聲至澄清。將BSA-FFA復(fù)合物溶液pH調(diào)至7.4，用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用前孵育?7 ℃。

3.6.2.2 上清液及細(xì)胞內(nèi)TG含量測(cè)定 各組細(xì)胞加樣處理24 h后，取50 μL待測(cè)細(xì)胞上清液，采用TG試劑盒測(cè)定TG含量，結(jié)果以對(duì)照組TG含量的百分比表示(%)。各組細(xì)胞加樣處理24 h后，小心棄去培養(yǎng)液，將板內(nèi)待測(cè)定細(xì)胞用PBS潤(rùn)洗2次后，每孔加入30 μL RIPA裂解液。充分裂解后，采用TG試劑盒測(cè)定TG含量，結(jié)果以對(duì)照組TG含量的百分比表示(%)。

3.6.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 采用游離脂肪酸(FFA)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞吞噬大量脂肪酸，使得細(xì)胞TG分泌提高，胞內(nèi)和上清液的TG顯著累積，此模型可以很好地模擬人體肝臟糖脂代謝紊亂的狀態(tài)。如圖4所示，模型組(Model)細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯高于正常組(Control)，可以表明HepG2細(xì)胞脂肪變性模型造模成功(P<0.001)。同時(shí)，如圖5所示，250 μg/mL和500 μg/mL兩個(gè)劑量組的胞內(nèi)TG和上清液TG含量明顯比模型組低20%～50%(與模型組比較，各濃度組顯著性差異P<0.01)，優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組二甲雙胍(MET)，也體現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

圖4 HepG2糖脂代謝實(shí)驗(yàn)胞內(nèi)TG結(jié)果

圖5 HepG2糖脂代謝實(shí)驗(yàn)上清液TG結(jié)果

4 討論

復(fù)合膳食纖維粉的主要原料為圓苞車(chē)前子殼、山楂、紅曲米、魔芋、桑葚、葛根、紫甘薯、聚葡萄糖和玉米低聚肽等。圓苞車(chē)前子殼為新食品原料，富含的膳食纖維高達(dá)80%以上，具有極高的保水性和膨潤(rùn)性。魔芋中含有高分子葡苷聚糖，同樣是一種具有強(qiáng)吸水性和膨脹性的膳食纖維。聚葡萄糖是一種可溶性膳食纖維，能夠降低總膽固醇和非高密度脂蛋白膽固醇水平，而不影響高密度脂蛋白膽固醇水平[10]。紅曲米是中國(guó)傳統(tǒng)藥食兩用品，由稻米經(jīng)發(fā)酵加工而成，具有活血化瘀、健脾消食等功效，不僅能降低總膽固醇、低密度脂蛋白、三酰甘油水平，還能升高高密度脂蛋白水平[11]。山楂為藥食兩用原料，性味酸、甘，微溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，可消食健胃、行氣散瘀、化濁降脂，用于肉食積滯、胃脘脹滿、瀉痢腹痛、瘀血經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀阻、心腹刺痛、胸痹心痛、疝氣疼痛的治療[12]。葛根為藥食兩用原料，味甘、辛，性涼，歸肺、胃經(jīng)，具有解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽(yáng)止瀉的功效，主治表證發(fā)熱、項(xiàng)背強(qiáng)痛、麻疹不透、熱病口渴、陰虛消渴、熱瀉熱痢、脾虛泄瀉[13]，對(duì)肝臟具有很好的保護(hù)作用。大量研究表明[14-17]，玉米低聚肽安全性高，具有降血壓、抗氧化、緩解疲勞、降膽固醇、保護(hù)肝臟的作用，是極具發(fā)展前景的材料。桑葚為藥食兩用原料，為?？浦参锷５母稍锕?，性甘、咸，平，歸肝、腎經(jīng)，具有固精縮尿、補(bǔ)腎助陽(yáng)的功效，用于遺精滑精、遺尿尿頻、小便白濁的治療[18]。

本研究結(jié)果表明，以圓苞車(chē)前子殼、聚葡萄糖、山楂、魔芋等原料開(kāi)發(fā)的復(fù)合膳食纖維粉的最佳配方為檸檬酸3.2%，紅曲米粉1.6%，魔芋粉3.0%，三氯蔗糖0.4%，其具有很好的調(diào)控脂質(zhì)代謝的作用。