張 浩，丁美紅，王曉艷

(1.臺(tái)州市中醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 318000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310000)

三七為五加科植物三七[pseudo-ginseng(Burk.)F.H.Chen]的干燥根。中醫(yī)認(rèn)為本品性溫，味甘微苦，擅化瘀血，又擅止血妄行，為血衄要藥。三七的現(xiàn)代化學(xué)成分研究表明其含有皂苷類成分、黃酮類成分、糖類成分、氨基酸類成分、三七素等。三七所含的各類化學(xué)成分相互協(xié)同，共同發(fā)揮了其獨(dú)有的功效作用。其中皂苷類成分也是三七主要的有效活性成分，其活血化瘀的功效也正是皂苷類成分所起的作用[1-5]。

目前臨床上常用的三七劑型有三七粉劑、三七煎劑、三七顆粒劑，但研究調(diào)查表明其在服用時(shí)的劑量、方式、送服水液類別、療程等方面也都不盡相同，加之患者本身對(duì)中藥服用知識(shí)也存在一定的誤區(qū)，其服用療效千差萬別。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)擬從多個(gè)維度對(duì)不同劑型三七譜圖及藥效學(xué)方面進(jìn)行全面的研究，建立譜圖與藥效之間的聯(lián)系，通過不同的數(shù)據(jù)處理技術(shù)來分析兩者的聯(lián)系，比較三七各個(gè)劑型之間的優(yōu)劣，初步闡明其主要化學(xué)成分對(duì)三七活血化瘀藥效的貢獻(xiàn)度，為進(jìn)一步研究其化學(xué)分子活血化瘀的機(jī)制，以及為中醫(yī)臨床上選擇合適的三七劑型提供科學(xué)依據(jù)。

1 三七粉劑、煎劑、顆粒劑化學(xué)成分含量測(cè)定

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀waters e2695+2489；Mettler AB 135-S分析天平，MT-XS55型電子分析天平；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋；1000W型電子萬用爐；MILLI-Q Synthesis UV型純水儀。

1.2 對(duì)照品與試劑

1.2.1 對(duì)照品 人參皂苷Rb1(批號(hào) 41753-43-9，HPLC≥98%)，人參皂苷Rg1(批號(hào)22427-39-0，HPLC≥98%)，三七皂苷R1(批號(hào)80418-24-2，HPLC≥98%)，以上均為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2.2 試劑 甲醇(色譜純)；水為超純水；其余試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 藥品

三七粉末(壽星牌，批號(hào)18218)；三七配方顆粒(廣東一方制藥有限公司，批號(hào)180402)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.5 色譜條件

色譜柱為Tigerkin ODS(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)，以水(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～12 min，19%B；12～60 min，19%→36%B)，流速1 mL·min-1，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 203 nm。在此條件下，樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1均達(dá)到基線分離，且分離度良好。見圖1。

1.6 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1 12.5 mg、11.5 mg、4.0 mg，溶于10 mL甲醇。分別取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.5 mL混勻，制備混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，即得濃度分別為三七皂苷R1 0.133 mg/mL、人參皂苷Rg1 0.383 mg/mL、人參皂苷Rb1 0.417 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合液。

1.7 供試品溶液制備

取三七粉劑、三七煎劑浸膏(三七稱重，加水10倍量，煎煮1 h，過濾，藥渣再加8倍量水，煎煮30 min，過濾，合并煎液，加熱揮發(fā)去多余水分干燥成膏)、三七顆粒約0.6 g，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，放置過夜，在80 ℃水浴上保持微沸2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.8 線性關(guān)系考察

分別準(zhǔn)確吸取“1.6”項(xiàng)下一定量的對(duì)照品溶液，置于棕色容量瓶混合并用甲醇定容，制備3個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液，依次注入液相色譜儀進(jìn)行分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程。三七皂苷的回歸方程為：y=0. 132 1x-0.004 6(r=0.999 7)，線性范圍0.066～0.665 mg/mL(n=6)；人參皂苷Rg1的回歸方程為：y=0.191 6x-0.007 3(r=0.999 8)，線性范圍0.191～1.910 mg/mL(n=6)；人參皂苷Rb1的回歸方程為：y=0.212 5x-0.013 9(r=0.999 7)，線性范圍0.209～2.09 mg/mL(n=6)。結(jié)果表明三七皂苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1在上述條件下濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

1.9 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，求得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為0.20%、0.27%、0.31%、0.25%、0.23%，說明精密度良好。

1.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10μL，分別于放置0、3、6、9、12、24 h后進(jìn)樣測(cè)定，求得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別0.21%、0.29%、0.27%、0.31%、0.33%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.11 重復(fù)性試驗(yàn)

制備同一批號(hào)供試品溶液6份，按擬定的色譜條件測(cè)定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.12%、1.21%、1.11%、1.74%、1.48%，表明重復(fù)性較好。

1.12 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品6份，分別加入對(duì)照品溶液適量(含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1)，按供試品溶液制備方法制備，0.45 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定。結(jié)果見表1、表2、表3。

表1 三七皂苷R1加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

表2 人參皂苷Rg1加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

表3 人參皂苷Rb1加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

1.13 測(cè)定結(jié)果

1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Rb1

表4 不同三七劑型化學(xué)成分含量測(cè)定結(jié)果

組別三七皂苷R1人參皂苷Rg1人參皂苷Rb1三七粉劑組0.65±0.122.56±0.141.95±0.09三七煎劑組0.61±0.082.45±0.091.88±0.11三七顆粒劑組0.47±0.050.77±0.080.57±0.06

圖1、表4結(jié)果表明，從主要化學(xué)成分含量角度分析，三七粉劑、三七煎劑之間的含量差異不明顯，三七顆粒劑與前兩者之間有一定差異。

2 三七粉劑、煎劑、顆粒劑活血化瘀藥效比較研究

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR清潔級(jí)小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(滬)2008-0016。

2.2 藥品與試劑

三七粉末(壽星牌，批號(hào)18218，三七顆粒，廣東一方制藥有限公司，批號(hào)180402)；酶免D-二聚體試劑盒(批號(hào)180322)；純凈水。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

ICR小鼠灌胃正常組：0.6 mL水/只/天灌胃，三七粉劑、煎劑、顆粒劑組：0.3 g/0.6 mL液體/只/天灌胃，給藥7 d，稱重，最后一次給藥1 h后摘眼球取血。采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清D-二聚體含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2.5 結(jié)果

三七粉劑、煎劑、顆粒劑組血清中D-二聚體含量與空白組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。服用不同劑型三七后，各給藥組小鼠體內(nèi)D-二聚體含量較空白組有不同程度的升高，初步表明服用三七可以活化小鼠的纖溶系統(tǒng)。三七粉劑、煎劑、顆粒劑組小鼠體內(nèi)D-二聚體含量比較無顯著差異。結(jié)果見表5。

組別給藥劑量(g·kg-1)D-二聚體空白組0.6mL/水416.92±15.10三七粉劑組0.3g/0.6mL461.28±25.54##三七煎劑組0.3g/0.6mL458.15±26.23##三七顆粒劑組0.3g/0.6mL439.57±15.54##

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 聚類分析分析不同三七劑型HPLC圖譜

不同三七劑型色譜峰的峰面積見表6。本實(shí)驗(yàn)采用SPSS19.0軟件，以歐氏距離平方和為相似性測(cè)度對(duì)色譜峰進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。從聚類結(jié)果可以看出：HPLC圖譜大致分為兩類，三七粉劑、三七煎劑為一類，三七顆粒劑為一類。結(jié)果見圖2。

表6 不同三七劑型的3個(gè)共有峰峰面積

圖2 三七粉劑、煎劑、顆粒劑聚類分析樹狀圖

通過研究三七粉劑、煎劑、顆粒劑的HPLC圖譜，對(duì)其主要化學(xué)成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1進(jìn)行了指認(rèn)，為三七的質(zhì)量控制及物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了依據(jù)。不同三七劑型的HPLC圖譜特征峰均一致，但有效成分含量有所差異。聚類分析結(jié)果表明：樹狀圖大致分為兩類，三七粉劑與煎劑為一類、三七顆粒劑為一類。

4 不同劑型三七的譜效關(guān)系研究

4.1 基本步驟

設(shè)有n個(gè)中藥樣品，每個(gè)樣品有m項(xiàng)指紋特征量化指標(biāo)，這樣構(gòu)成了m個(gè)子序列。以樣品藥效學(xué)指標(biāo)作為母序列，依據(jù)母序列與子序列關(guān)聯(lián)度的大小，可確定各指紋特征對(duì)藥效貢獻(xiàn)的大小。

4.1.1 原始數(shù)據(jù)變換 原始數(shù)據(jù)的變換有均值化變換、初值化變換和標(biāo)準(zhǔn)化變換等幾種方法。

4.1.2 求絕對(duì)差序列 經(jīng)數(shù)據(jù)變換的母序列記為{Xo(k)}，子序列記為{Xi(k)}，則絕對(duì)差序列Δoi(k)可由式(3-1)計(jì)算。

Δoi(k)=│Xo(k)一Xi(k)│(3-1)

4.1.3 求關(guān)聯(lián)系數(shù) 關(guān)聯(lián)系數(shù)反映兩個(gè)被比較序列的靠近程度。母序列{Xo(k)}與子序列{Xi(k)}的關(guān)聯(lián)系數(shù)Loi(k)可由式(3-2)計(jì)算。

Loi(k)=(Δmin+ρΔmax)/(Δoi(k)+ρΔmax)

(3-2)

Δmin為二級(jí)最小差；Δmax為二級(jí)最大差；ρ為分辨系數(shù)，意義是削弱最大絕對(duì)差數(shù)值太大引起的失真，提高關(guān)聯(lián)系數(shù)之間的差異顯著性，ρ∈(0，1)。

4.1.4 求關(guān)聯(lián)度 在算出子序列與母序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)后，計(jì)算各類關(guān)聯(lián)系數(shù)的平均值，這個(gè)平均值稱為這兩個(gè)序列的關(guān)聯(lián)度。

4.1.5 關(guān)聯(lián)序 將各子序列對(duì)同一母序列的關(guān)聯(lián)度按大小順序排列起來，便組成關(guān)聯(lián)序，其直接反映各個(gè)子序列對(duì)母序列的貢獻(xiàn)的大小，據(jù)此可確立各指紋特征峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分與藥效間的聯(lián)系。

4.2 不同三七劑型HPLC圖譜與藥效作用灰關(guān)聯(lián)度

4.2.1 活血化瘀的藥效指標(biāo)R值 為了將藥效結(jié)果量化，進(jìn)而能與HPLC圖譜相結(jié)合，分析兩者的關(guān)系。對(duì)于D-二聚體，將空白組的藥效值定位100%，其他的藥效值依次量化。結(jié)果見表7。

表7 不同三七劑型活血化瘀功效的R值

4.2.2 子序列與母序列 表7列出了不同三七劑型活血化瘀藥效的R值，表6列出了不同三七劑型HPLC圖譜3個(gè)共有峰峰面積數(shù)據(jù)。前者為母序列，后者為子序列。

4.2.3 原數(shù)據(jù)變換 子序列和母序列存在測(cè)度不一致的問題，在此采用均值化對(duì)原數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)格化處理見式(3-3)。

Yik=Xik/Xk

(3-3)

式中，Yik為變換后的數(shù)據(jù)，Xik為原始數(shù)據(jù)，Xk為第k列數(shù)據(jù)的均值。結(jié)果見表8、表9。

表8 不同三七劑型活血化瘀藥效的R值均值化數(shù)據(jù)

表9 不同三七劑型HPLC圖譜共有色譜峰面積均值化

4.2.4 計(jì)算關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度 以《中國藥典》中三七的含量測(cè)定成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1與其活血化瘀的藥效學(xué)建立關(guān)聯(lián)度，表10列出了不同三七劑型活血化瘀藥效指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度。

表10 不同三七劑型活血化瘀藥效指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度

4.2.5 排關(guān)聯(lián)序 表11列出了不同三七劑型活血化瘀藥效指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)序。

表11 不同三七劑型活血化瘀藥效指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)序

4.2.6 結(jié)果 研究結(jié)果表明，3特征峰代表的化學(xué)成分與藥效指標(biāo)具有較高的關(guān)聯(lián)度。依據(jù)關(guān)聯(lián)度的大小，確定各成分對(duì)活血化瘀貢獻(xiàn)大小順序?yàn)椋?>2>1，即人參皂苷Rb1>人參皂苷Rg1>三七皂苷R1。說明三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1等對(duì)三七活血化瘀藥效起到一定的作用，其中人參皂苷Rb1的貢獻(xiàn)度最大。

5 分析與討論

譜效關(guān)系的研究方法有很多，常用的有相關(guān)分析、普通多元線性回歸、偏最小二乘法(PLS)和灰色相關(guān)法?；疑P(guān)聯(lián)度分析通過描述系統(tǒng)發(fā)展過程中因素間相對(duì)變化的關(guān)聯(lián)性，根據(jù)關(guān)聯(lián)度和關(guān)聯(lián)序判斷藥效指標(biāo)與哪些色譜峰關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)，哪些較弱，可以綜合評(píng)價(jià)某些化學(xué)成分對(duì)藥效的貢獻(xiàn)度。單味中藥也是復(fù)雜的化學(xué)分子復(fù)方，其化學(xué)成分復(fù)雜，功效也多樣化。因此，采用灰度理論以量化數(shù)據(jù)的方式，科學(xué)、有效地篩選出與藥效最相關(guān)的主要化學(xué)成分，可以為進(jìn)一步深入研究化學(xué)分子的藥效機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

現(xiàn)代藥理研究表明，三七富含皂苷類、多糖、黃酮類成分，通過影響機(jī)體內(nèi)源性凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)和血小板聚集而產(chǎn)生活血化瘀的作用。三七的功效作用是其內(nèi)部各成分協(xié)同作用的結(jié)果，各特征峰代表的化學(xué)成分與其藥效的關(guān)聯(lián)程度雖不一樣，但都起到了一定的作用。在量化數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，不同劑型三七的HPLC圖譜和譜效關(guān)聯(lián)度中都有所體現(xiàn)。不同劑型的三七的活血化瘀功效、化學(xué)成分和藥效的關(guān)聯(lián)度不盡相同[6-12]。

本研究采用灰色關(guān)聯(lián)分析，確定了三七粉劑、煎劑、顆粒劑HPLC圖譜特征峰所代表的化學(xué)成分對(duì)活血化瘀功效貢獻(xiàn)度的大小，即人參皂苷Rb1>人參皂苷Rg1>三七皂苷R1。三七中其他成分的具體功效還有待進(jìn)一步深入研究。