吳 晶，楊懷鏡，周 萍

(1.大理大學 藥學與化學學院，云南 大理 671000；2.大理州食品藥品檢驗所，云南 大理 671000)

紅花(CarthamustinctoriusL.)又名次紅花、紅花草、紅花菜、紅藍花等，為一種菊科植物的干燥管狀花[1]，性溫，味苦，具有通經(jīng)、活血和止疼等功效[2-4]，為民間常用的活血化瘀藥。現(xiàn)代藥理學研究表明，紅花具有抗炎、抗腫瘤、保護心血管、免疫力調節(jié)等作用[5-11]。根據(jù)文獻報道紅花中含有山奈素、槲皮素、羥基紅花黃色素A、腺苷、沒食子酸、原兒茶酸和金絲桃苷等多種化學成分。何婷等[12]采用HPLC法同時測定紅花中羥基紅花黃色素A、山奈素、槲皮素和蘆丁的含量。紅花中山奈素的測定需要鹽酸水解，而蘆丁水解產(chǎn)物有槲皮素和異槲皮苷等[13]，若同時測定山奈素需要將紅花進行水解，對紅花中蘆丁及槲皮素含量有影響。本實驗采用HPLC法同時測定云南不同產(chǎn)地紅花樣品中槲皮素、蘆丁、原兒茶酸和羥基紅花黃色素A的含量，對紅花中多個指標成分進行分析，旨在為云南紅花藥材的質量控制提供參考。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗材料

本研究所用紅花樣品主要采集于云南大理和麗江2個城市的不同地方，共25批，均經(jīng)大理白族自治州食品藥品檢驗所楊懷鏡主任藥師鑒定為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，憑證標本放于大理白族自治州食品藥品檢驗所標本室，樣品自然陰干后粉碎，放入干燥容器中于室溫下避光保存。樣品信息見表1。

表1 紅花樣品信息

1.2 實驗儀器

本研究所用試劑乙腈、甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為實驗室自制超純水。本研究所用儀器見表2，樣品信息見表3。

表2 儀器信息

表3 樣品信息

2 試驗方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素、沒食子酸、蘆丁、原兒茶酸和羥基紅花黃色素A對照品適量，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得到相應的對照品儲備液。再量取上述對照品儲備液各1.0 mL，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得到槲皮素、沒食子酸、蘆丁、原兒茶酸、羥基紅花黃色素A濃度分別為143.60、4.89、41.20、11.72、22.22 g·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱定紅花供試品粉末約0.2 g，置具塞錐形瓶中，加入25%的甲醇溶液25 mL，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)40 min，冷卻，再精密稱定重量，用25%的甲醇補重，搖勻，濾過，用微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：采用波長切換(表4)；流動相：甲醇-0.2%磷酸水溶液，柱溫30 ℃，進樣量5 μL，流速1.0 mL·min-1，梯度洗脫程序見表5。

表4 波長切換程序

表5 梯度洗脫程序

2.3 方法學考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗按“2.1”項下方法制備混合對照品溶液和紅花S2樣品的待測溶液，按“2.2”項下的液相色譜條件進行測定，得到HPLC圖譜，混合對照品溶液和S2供試品溶液的色譜見圖1和圖2。

注：1-沒食子酸；2-原兒茶酸；3-羥基紅花黃色素A；4-蘆?。?-槲皮素

注：1-沒食子酸；2-原兒茶酸；3-羥基紅花黃色素A；4-蘆?。?-槲皮素

所得的圖譜中沒食子酸、原兒茶酸、羥基紅花黃色素A、蘆丁和槲皮素與供試品中其他組分分離效果良好，5種待測成分與其他成分均能達到基線分離，分離度均>1.5，理論塔板數(shù)均>5 000。

2.3.2 線性關系考察 分別精密吸取“2.1”項下方法制備的混合對照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL于10 mL的容量瓶中，加25%的甲醇定容至刻度，混勻，即得系列混合對照品溶液，按“2.2”項下的色譜條件依次進樣測定，以對照品的濃度X((g·mL-1)為橫坐標，以其相應的峰面積Y為縱坐標繪制回歸曲線，結果見表6，結果顯示各組分線性關系均良好。

表6 回歸方程、相關系數(shù)及線性范圍

2.3.3 精密度試驗 取“2.1”項下制備的混合對照品溶液連續(xù)進樣6次，分別計算各成分6次進樣峰面積的RSD值，結果沒食子酸、HSYA、原兒茶酸、蘆丁、槲皮素峰面積的RSD值分別為1.10%、0.95%、1.35%、1.31%、1.33%，表明儀器的精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取S2紅花粉末樣品約0.2 g，平行稱取6份，精密稱定，按“2.1”項下的方法制備樣品溶液，按“2.2”項下的色譜條件進行測定，并記錄，然后計算出5種成分含量的RSD值。沒食子酸、HSYA、原兒茶酸、蘆丁、槲皮素的平均含量為1.70 mg·g-1、894.44 mg·g-1、22.99 mg·g-1、37.23 mg·g-1、1.35 mg·g-1，RSD值分別為1.59%、1.58%、0.60%、1.24%、0.51%，表明實驗建立的HPLC法同時測定5種成分的重復性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取S2紅花樣品約0.2 g，精密稱定，按“2.1”項下的方法制備樣品溶液，分別于放置0、2、4、6、8、16、24 h時，按“2.2”項下的色譜條件進行測定，并記錄相應的色譜圖，計算5種成分峰面積的RSD值，沒食子酸、羥基紅花黃色素A、原兒茶酸、蘆丁、槲皮素的RSD值分別為1.46%、0.24%、0.20%、1.22%、0.35%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗 取已知含量的S2紅花樣品(沒食子酸含量為1.73 mg·g-1，羥基紅花黃色素A的含量為892.24 mg·g-1，原兒茶酸含量為23.97 mg·g-1，蘆丁含量為36.34 mg·g-1，槲皮素含量為1.36 mg·g-1)約0.2 g，精密稱定，平行稱取9份，分為高、中、低三組，每組分別加入相應的沒食子酸、原兒茶酸、羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素對照品，按“2.1”項下的方法制備供試品溶液，按“2.2”項下的色譜條件進樣測定，記錄并計算5種成分的加樣回收率。見表7-表11。

表7 紅花樣品中沒食子酸加樣回收試驗結果 (n=9)

表8 紅花中羥基紅花黃色素A加樣回收試驗結果 (n=9)

表9 紅花中原兒茶酸加樣回收試驗結果 (n=9)

表10 紅花中蘆丁加樣回收試驗結果 (n=9)

表11 紅花中槲皮素加樣回收試驗結果 (n=9)

2.4 含量測定

分別稱取云南不同產(chǎn)地的紅花粉末樣品約0.2 g，精密稱定，每批平行稱取3份，按“2.1”項下的方法制備供試品溶液，按“2.2”項下的色譜條件測定，記錄峰面積，按外標法計算供試品溶液中5種成分的含量，結果見表12。

表12 5種成分的含量測定結果 (n=3)

續(xù)表12 5種成分的含量測定結果 (n=3)

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

實驗考察了甲醇-0.2%磷酸水溶液、甲醇-0.4%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等不同流動相梯度洗脫的分離效果，結果顯示以甲醇-0.2%磷酸水溶液為流動相梯度洗脫，5種成分色譜峰峰形較好，與供試品中其他成分分離較完全，故選擇流動相甲醇-0.2%磷酸水溶液作為流動相。

實驗考察了Waters Symmetry-C18、Waters XSELECETTMGSHTMC18、Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱對供試品中待測組分與其他成分的分離度，結果顯示，Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱的分離效果較其他色譜柱更好，故選擇Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱。

實驗也考察了流速(0.5、0.8、1.0、1.2 mL·min-1)、柱溫(20、25、30、35 ℃)對分離效果的影響。結果顯示，流速、柱溫的變化僅引起色譜峰保留時間的改變，峰面積和峰型沒有影響，綜合考慮實際測定要求和色譜柱的使用壽命，選擇流速 1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃。

對于波長的選擇，通過對5種成分混合對照品溶液進行分析，沒食子酸和原兒茶酸在254 nm波長處有較大吸收，而羥基紅花黃色素A、蘆丁和槲皮素則在360 nm處均有吸收，故采用波長切換進行實驗使色譜峰分離效果更好。

3.2 同時測定7種成分的考察

實驗同時測定了沒食子酸、羥基紅花黃色素A、腺苷、金絲桃苷、原兒茶酸、蘆丁和槲皮素7種成分的含量，所得結果中S1、S2、S4、S24、S25樣品中腺苷含量為0.20 mg·g-1、0.17 mg·g-1、0.10 mg·g-1、0.25 mg·g-1、0.18 mg·g-1，其他批次樣品中腺苷含量為0；金絲桃苷的測定結果S1、S8、S9、S15、S21、S24、S25含量分別為0.10 mg·g-1、0.072 mg·g-1、0.090 mg·g-1、0.093 mg·g-1、0.22 mg·g-1、0.80 mg·g-1、0.071 mg·g-1，其他批次樣品中未檢出金絲桃苷。結果表明云南紅花中多個產(chǎn)地紅花中無腺苷和金絲桃苷。張戈比較了不同品種紅花中腺苷的含量，其中新疆吉木薩爾無刺紅花含量最高，而塔城無刺紅花、余姚紅花、合肥紅花、新鄉(xiāng)紅花、菏澤紅花等未檢出腺苷。

3.3 結果分析

25批云南不同產(chǎn)地紅花樣品中5種成分的含量存在一定的差異，可能不同產(chǎn)地土壤、環(huán)境、氣候等多種條件對紅花中多種有效成分有影響。

本研究初步建立了HPLC波長切換法同時測定紅花藥材中5種不同化學成分的含量，結果表明，本方法靈敏度較高，分離度好，重復性良好，適用于紅花中沒食子酸、原兒茶酸、羥基紅花黃色素A、蘆丁和槲皮素的含量測定。