牛 濤，徐 波，陳 紅，張學(xué)敏

(天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司，天津 300410)

養(yǎng)血清腦顆粒是天津天士力制藥股份有限公司研制、生產(chǎn)的國(guó)家三類中藥新藥，以宋代中醫(yī)名著《太平惠民和劑局方》的“四物湯”為基礎(chǔ)加味并采用最新工藝研制而成的制劑，具有養(yǎng)血活血、平肝潛陽的作用，用于血虛肝亢所致的頭痛、眩暈眼花、心煩易怒、失眠多夢(mèng)。藥理學(xué)研究表明養(yǎng)血清腦顆粒具有改善軟腦膜微循環(huán)、增加腦血流量、緩解血管痙攣、止痛等作用[1]。白芍浸膏是養(yǎng)血清腦顆粒和養(yǎng)血清腦丸的制劑中間體，制備工藝為：白芍加適量乙醇溶液提取2次，回收乙醇并濃縮至適量。

白芍來源于毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根。白芍的主要功效為平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗。與養(yǎng)血清腦顆粒養(yǎng)血平肝、活血通絡(luò)的功效相契合，因此，白芍在養(yǎng)血清腦顆粒配方中發(fā)揮著重要作用。白芍的化學(xué)成分主要為單萜及其苷類、三萜類、芳香酸及其黃酮及其苷類、鞣質(zhì)類、多糖類、揮發(fā)油等[2-3]。我們前期針對(duì)白芍浸膏進(jìn)行了深入研究，建立了白芍浸膏的UPLC色譜分離方法，對(duì)主要色譜峰進(jìn)行了質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析和對(duì)照品比對(duì)，確定了6種主要成分，分別為芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、五沒食子酰葡萄糖、沒食子酸、苯甲酸和兒茶素[4]。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

Waters Acquity超高效液相色譜儀，TUV紫外檢測(cè)器，Empower3化學(xué)工作站(美國(guó)Waters公司)；AG104電子天平(瑞士 METTLER公司)；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(美國(guó) MILLIPORE公司)。

1.2 試藥

芍藥苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100231-200801)；沒食子酸(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111900-200905)；芍藥內(nèi)酯苷(天津一方科技，批號(hào)20150901)；五沒食子酰葡萄糖(天津一方科技，批號(hào)20160204)；兒茶素(天津一方科技，批號(hào)20160302)；苯甲酸(天津一方科技，批號(hào)20160201)、白芍浸膏(天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司，批號(hào)S20160201)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用ACQUITY UPLC HSS T3(2.14 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱，以0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫條件見表1，流速為0.4 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品圖譜(a)和白芍提取物圖譜(b)

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、五沒食子酰葡萄糖、沒食子酸、苯甲酸和兒茶素對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制得每毫升含芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、五沒食子酰葡萄糖、沒食子酸、苯甲酸和兒茶素分別為0.1 mg、0.04 mg、0.04 mg、0.01 mg、0.001 mg和0.002 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶劑的制備

取白芍浸膏約0.3 g至25 mL量瓶中，精密稱定，加80%甲醇適量，超聲處理20 min(功率150 W，頻率40 kHz)，放冷至室溫，再加80%甲醇至刻度，搖勻，精密量取1 mL，至10 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，即得。

分別取對(duì)照品和供試品溶液各2 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 線性范圍

精密稱取經(jīng)沒食子酸、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖和苯甲酸對(duì)照品適量，加甲醇配制成每毫升含沒食子酸、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖和苯甲酸對(duì)照品適量分別為0.1 mg、0.008 mg、0.04 mg、0.4 mg、0.05 mg和0.05 mg的混合對(duì)照溶液，再分別量取0.5、1、2、4、5、10 mL混合對(duì)照溶液置于50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，混勻，制成系列溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定，以濃度對(duì)測(cè)得的峰面積進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程。結(jié)果見表2。

表2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

3.2 精密度試驗(yàn)

取上述供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量2 μL，記錄沒食子酸、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖和苯甲酸的峰面積，峰面積的RSD分別為0.9%、0.1%、1.8%、0.5%、2.1%和0.6%，結(jié)果表明精密度良好。

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取白芍浸膏6份，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量2 μL，計(jì)算各成分含量。沒食子酸、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖和苯甲酸的平均含量分別為0.62%、0.20%、2.74%、8.53%、2.96和0.10%，RSD分別為1.2%、1.9%、1.1%、1.1%、1.1%和1.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.4 回收率試驗(yàn)

精密稱取白芍浸膏6份，每份約0.15 g，置25 mL量瓶中，各分別精密加入混合對(duì)照品溶液5 mL(每毫升含沒食子酸、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖和苯甲酸分別為0.187 2 mg、0.060 5 mg、0.827 2 mg、2.573 4 mg、0.895 2 mg和0.029 6 mg)，自“加70%甲醇溶液適量，超聲溶解”起，照含量測(cè)定項(xiàng)下依法處理，作為供試品溶液，取2 μL注入色譜儀，分別計(jì)算沒食子酸、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖和苯甲酸的回收率。結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

續(xù)表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄沒食子酸、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、五沒食子酰葡萄糖和苯甲酸的峰面積，峰面積的RSD分別為0.8%、2.3%、1.5%、1.0%、2.8%和2.4%，結(jié)果顯示供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6 樣品含量測(cè)定

取不同批次的白芍浸膏，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算6種成分的含量。見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果 (%)

4 討論

本研究采用超高效液相色譜法(UPLC)進(jìn)行測(cè)定，能夠在5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)6種成分的有效分離，高效快速，穩(wěn)定性好，靈敏度更高，提高了產(chǎn)品質(zhì)量控制水平，為產(chǎn)品藥效成分研究提供數(shù)據(jù)支持[5]。

中藥材和中藥復(fù)方成分種類復(fù)雜，研究中常會(huì)碰到同時(shí)測(cè)定多個(gè)成分且各成分的紫外吸收不同的問題，本研究采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)測(cè)定成分進(jìn)行了紫外吸收特性分析，通過相似度數(shù)據(jù)比較，最終確定采用230 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，能夠很好地兼顧各測(cè)定成分。

流動(dòng)相中加酸可以改善峰形和分離度，比較了相同濃度的甲酸、冰醋酸、磷酸溶液，加入甲酸和冰醋酸后，基線噪音大且有倒峰，加入磷酸則基線平穩(wěn)，所以選用磷酸。分別試驗(yàn)了0.05%、0.1%、0.2%的磷酸，結(jié)果表明0.1%的磷酸效果最佳。