孟慶慶，特布新，奧·烏力吉，2*

(1.內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

小秦艽花，蒙古文名音譯“呼和-朱力根-其木格”[1]“幫占-奧恩布”[2]，為龍膽科植物小秦艽(GentianadahuricaFisch.)的干燥花，常于夏、秋二季花開放時(shí)采收，除去雜質(zhì)，及時(shí)干燥。小秦艽花具有清熱解毒、止咳祛痰的功效，生于草原、山地、草甸、灌叢，分布于我國內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、新疆等地[3]。該藥材較早收載于《無誤蒙藥鑒》《認(rèn)藥白晶鑒》等經(jīng)典蒙醫(yī)藥著作[4-5]中，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)《內(nèi)蒙古蒙藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1986版)除就其【性狀】做了規(guī)定外，【鑒別】項(xiàng)下僅有粉末顯微鑒別法；1998年升級載入《中國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊》，【鑒別】項(xiàng)下增加了黃酮類化合物的一般理化鑒別法，無檢查和含量測定項(xiàng)。因此，提升小秦艽花質(zhì)量控制方法，確保蒙醫(yī)臨床用藥的安全性意義重大。本文建立了小秦艽花的薄層鑒別和含量測定方法，并對小秦艽花進(jìn)行了水分、灰分、酸不溶性灰分和浸出物等的測定，所建立的方法快速簡便，準(zhǔn)確可靠，可行性高，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材

7批樣品經(jīng)內(nèi)蒙古自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所原蒙藥室主任康雙龍，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院教授額日敦·嘎日迪，內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院教授布和巴特爾，內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院教授吳香杰，內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院特聘專家白明剛，通遼市食品藥品檢驗(yàn)所中蒙藥室主任安文遠(yuǎn)鑒定，均為GentianadahuricaFisch.的干燥花。樣品采集信息見表1。

表1 小秦艽花樣品采集信息

1.2 儀器

Alliance e2695高效液相色譜儀(Waters)；Mettler Toledo NewClassic MS105電子天平 d=0.01 mg[梅特勒-托利多儀器(上海)]有限公司；娃哈哈飲用純凈水(山東省濟(jì)南市)；KQ-600DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BS224S電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器系統(tǒng)有限公司)；SQP電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]。

1.3 試藥

異葒草苷對照品(含量測定用，批號111974-201401，中國食品藥品檢定研究院)；聚酰胺薄膜(薄層層析用，天津思利達(dá)科技有限公司)；甲醇為色譜級(天津星馬克科技發(fā)展有限公司)；水為娃哈哈飲用純凈水；磷酸、甲醇、乙醇等所用試劑均為分析純(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 供試品溶液制備 取本品粉末0.5 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液制備 取異葒草苷對照品，加甲醇制成每l mL含0.3 mg異葒草苷的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3 薄層色譜鑒別 按照《中國藥典》(2015年版四部通則0502)薄層色譜法試驗(yàn)[6]，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以展開劑：①甲醇-水-冰醋酸(6∶1∶1，使用量×2=16 mL)；②乙醇-水-冰醋酸(4∶1∶1，使用量×2=12 mL)；③丙酮-水-冰醋酸(3∶1∶1，使用量×3=15 mL)，將不同產(chǎn)地7批次小秦艽花供試品溶液進(jìn)行展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鋁試液，置于紫外光燈(254 nm)下檢視。結(jié)果三個(gè)展開系統(tǒng)的供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，均顯相同顏色的斑點(diǎn)；斑點(diǎn)Rf值適宜，顯色清晰，色譜分離好。尤以展開劑甲醇-水-冰醋酸(6∶1∶1)更佳，且信息量多，故用于耐用性考察。結(jié)果見圖1。

2.1.4 耐用性考察 吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，展開條件為A.室溫展開(T=25 ℃，RH=5%)；B.冰箱冷藏室展開(T=5 ℃)；C.點(diǎn)樣板RH75%(氯化鈉過飽和溶液控制)預(yù)平衡30 min后，室溫展開；D.點(diǎn)樣板RH20%(醋酸鉀過飽和溶液控制)預(yù)平衡30 min后，室溫展開，按上述方法顯色檢視。結(jié)果見圖2。

A.甲醇-水-冰醋酸(6∶ 1∶1)B.乙醇-水-冰醋酸(4∶ 1∶1)C.丙酮-水-冰醋酸(3∶1∶1)

A.室溫展開(T25 ℃，RH5%)；B.冰箱冷藏室展開(T5℃)；C.點(diǎn)樣板RH75%預(yù)平衡30 min后，室溫展開；D.點(diǎn)樣板RH20%預(yù)平衡30 min后，室溫展開

2.2 檢查

2.2.1 水分測定 按照《中國藥典》2015年版四部通則0832水分測定法第二法[6]，對7批藥材的水分進(jìn)行考察。結(jié)果7批小秦艽花水分為4.64%～5.27%，平均值為4.93%。

2.2.2 灰分測定法、酸不溶性灰分 照《中國藥典》2015年版四部(通則2302)灰分測定法[6]，對7批樣品的總灰分及酸不溶性灰分進(jìn)行了考察測定。結(jié)果7批小秦艽花總灰分為4.68%～9.64%，平均值為6.53%，酸不溶性灰分為0.70%～4.56%，平均值為2.16%。

2.2.3 重金屬檢查 對本品中的重金屬含量進(jìn)行了限量考察。參照有關(guān)文獻(xiàn)(CHP2005I/阿膠)，取本品內(nèi)容物1.00 g，按照《中國藥典》2015年版四部(通則0821)重金屬檢查法第二法依法操作檢查[6]。結(jié)果每批樣品每1 g內(nèi)容物中的重金屬含量均少于10 μg，即均低于百萬分之十。

2.2.4 砷鹽檢查 對本品中的砷鹽含量進(jìn)行了限量考察。參照有關(guān)文獻(xiàn)(CHP2005I/阿膠)，取本品4.0 g，加無砷氫氧化鈣2 g，混合，加少量水，攪勻，干燥后先用小火燒灼使碳化，再在500～600 ℃熾灼使完全灰化，放冷，加鹽酸4 mL與適量的水使溶解成50 mL，分取溶液12.5 mL，加鹽酸4 mL與水11.5 mL，按照中國藥典2015年版四部(通則0822)砷鹽檢查法第一法[6]，標(biāo)準(zhǔn)砷對照液的制備，自“再加碘化鉀試液5mL”起，依法操作[8]。結(jié)果7批次供試品中，每1 g內(nèi)容物中的砷鹽含量均少于2 μg，即均低于2%。

2.3 浸出物

按照醇溶性浸出物測定法(《中國藥典》2015年版四部通則2201)項(xiàng)下的熱浸法測定[6]，用75%乙醇做溶劑，結(jié)果7批小秦艽花浸出物為32.22%～40.85%，平均值為36.81%。

2.4 含量測定

按照高效液相色譜法(通則0512)測定[6]。

2.4.1 色譜條件 色譜柱為XSelect HSS T3(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相為甲醇-0.04%磷酸溶液(33∶67)；檢測波長為350 nm；流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.4.2 對照品溶液制備 取異葒草苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含異葒草苷0.1604 mg的溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液制備 取本品粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇10 mL，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 測定方法 精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置有異葒草苷的吸收峰。結(jié)果見圖1、圖2。

圖3 異葒草苷對照品HPLC色譜

圖4 小秦艽花供試品HPLC色譜

2.4.5 線性關(guān)系考察 精密吸取濃度分別為0.032 08、0.064 16、0.096 24、0.128 32、0.160 4 mg/mL的異葒草苷對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積值。并以進(jìn)樣量C(x)對峰面積值A(chǔ)(y)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=27 032 644.20x-21 098.74，相關(guān)系數(shù)r=1.00。結(jié)果異葒草苷進(jìn)樣量在0.320 8～1.604 μg范圍內(nèi)，與峰面積值具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)性顯著。

2.4.6 精密度試驗(yàn) 取同一濃度的異葒草苷對照品溶液，在24 h內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，測定異葒草苷的峰面積，計(jì)算峰面積RSD為0.23%。結(jié)果表明日內(nèi)精密度良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于第0、2、4、8、12、24 h，精密吸取X4(批號20170828)供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積值。結(jié)果其RSD為0.87%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)測定穩(wěn)定性良好。

2.4.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品X4(批號20170828)，按照“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積值，并計(jì)算含量。結(jié)果其RSD為1.61%。表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.4.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品X4(批號20170828；含量0.15%)約0.25 g，共9份，精密稱定，分三組，按樣品中含量-對照品加入量1∶0.5、1∶1、1∶1.5的要求分別依次精密加入異葒草苷對照品儲(chǔ)備液(0.160 4 mg/mL)適量，按照“2.4.3”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，測定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

回收率試驗(yàn)結(jié)果符合藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則(中國藥典2015年版四部通則9101)[6]規(guī)定(待測定成分含量0.1%，回收率限度90%～108%)，表明本試驗(yàn)所采用的測定方法結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于小秦艽花的含量測定。

2.4.10 不同產(chǎn)地樣品含量測定 取小秦艽花樣品約0.5 g，精密稱定，分別按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，測定，并計(jì)算含量。結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地樣品含量測定結(jié)果

3 討論

取異葒草苷對照品溶液，按照高效液相色譜法(中國藥典2015年版四部通則0512)，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果在350 nm處有最大吸收，故測定波長確定為350 nm。

曾首選所含龍膽苦苷作為定量控制小秦艽花質(zhì)量的特征指標(biāo)成分，進(jìn)行了高效液相色譜法測定其含量的研究[7]。結(jié)果因含量比異葒草苷低，故參考文獻(xiàn)選擇本品所含異葒草苷作為定量控制本品質(zhì)量的特征指標(biāo)成分，按照“中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”要求，進(jìn)行了高效液相色譜法測定小秦艽花中異葒草苷含量的研究[8]。結(jié)果該方法簡便、快捷、準(zhǔn)確、重復(fù)性好。

溶劑濃度考察方面，樣品取6份，依次加入60%～85%的甲醇溶劑，按提取方法處理，測定其含量。結(jié)果表明75%甲醇提取液含量較高，故提取溶劑乙醇濃度選定75%。

提取時(shí)間考察方面，取4份樣品，精密加入溶劑，依次超聲處理(功率500 W，頻率4 0kHz)10 min、20 min、30 min、40 min(其余步驟按提取方法處理)，結(jié)果表明平均提取量為0.140 5%，RSD為1.88%，差異明顯。故采用超聲30 min提取。

色譜系統(tǒng)性試驗(yàn)考察方面，取已知含量的樣品X4(批號20170806)約0.5 g，主要采用兩種色譜柱XSelect HSS T3(5 μm，4.6 mm×250 mm)，Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6 mm×25 0 mm)；測定小秦艽花中異葒草苷的含量，結(jié)果無顯著性差異，RSD為1.79%、0.70%。

綜上所述，該實(shí)驗(yàn)所采用的測定方法簡便，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，重復(fù)性好，可用于樣品測定，為小秦艽花的研究提供了參考依據(jù)。