王 麗

(廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 511360)

我國地勢多樣，資源豐富，少數(shù)民族眾多，藥浴是少數(shù)民族人們?nèi)粘１＝　⒎啦≈尾∷豢扇鄙俚囊徊糠?。藥浴也是中醫(yī)治療方法中外治法的一種，其歷史悠久。藥浴亦被現(xiàn)代人稱為“綠色療法”。

復(fù)方金盞銀盤藥浴包處方取自我國嶺南地區(qū)，由金盞銀盤、黃皮葉、黃牛葉、黃桐葉、黃梔子葉組成，民間婦孺皆知，療效確切。主要功效為清熱解毒、消癰療瘡、祛濕止癢，用于治療全身上下的皮膚瘙癢疾病，如濕疹、痱子、蛇蟲咬傷、痔瘡、疥癬等。然而這樣一種家喻戶曉、療效確切的藥浴方藥無確切的實驗依據(jù)，不僅不能使其藥效得到充分發(fā)揮，也阻滯地方文化傳播，不利于其推廣。鄧書保[1]提出對于地方藥浴文化的系統(tǒng)和整體性保護是對于國家民族文化的保護，需要以多渠道方式進行。此藥浴方藥中的單味藥物有部分報道，都波等[2]用Fenton法檢測出金盞銀盤黃酮成分對·OH有較好的清除作用。滕蓉等[3]研究發(fā)現(xiàn)其可抑制金黃色葡萄球菌等菌類。另外，也有研究顯示鬼針草有抗炎、治療高血壓、高血糖、胃潰瘍[4-7]等作用。李娟等[8]運用ELISA法、MTT法、Western Blot法檢測發(fā)現(xiàn)黃皮葉提取物可減少炎癥因子。而以金盞銀盤、黃皮葉、黃牛葉、黃桐葉、黃梔子葉為主要成分的復(fù)方藥浴方藥的研究，在國內(nèi)外尚無報道。現(xiàn)對破壁提取總黃酮的最佳工藝進行研究，為其后期開發(fā)推廣提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV2350型紫外可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司)；FA1004型電子分析天平(上海衡平儀器儀表廠)；DK-500s型三用恒溫水槽(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；DFT250型手提式高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)。

1.2 材料

蘆丁對照品(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，批號：170115)；纖維素酶(和氏璧生物科技有限公司，批號：2017090802)；氫氧化鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20160820)；無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉均為分析純，購于天津市百世化工有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法[9]

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取干燥的蘆丁對照品 10 mg，置于 100 mL量瓶中，加60%乙醇適量使蘆丁溶解，冷卻后，用60%乙醇定容至刻度線，搖勻即得濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 吸取標(biāo)準(zhǔn)液2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL于6只10 mL的比色管中，加30%乙醇使各溶液成5 mL，分別加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，分別加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻放置6 min，分別加1 mol/L氫氧化鈉溶液3 mL，定容至刻度線，搖勻放置15 min，于510 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制濃度X-吸光度Y的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。運用線性回歸法得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=5.437 4X+0.104 9，r=0.999 6，Y為吸光度值，X為濃度mg/mL。結(jié)果顯示，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在0.052～0.117m g/g濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3 樣品中總黃酮的測定方法 復(fù)方藥材5 kg粉碎，過50目篩，備用，取8 g粉末樣品按比例添加純凈水、纖維素酶，放置燒杯中，同時置于水浴鍋中，設(shè)定溫度和時間水浴加熱，過濾得總黃酮樣液，取一定量的樣液，定容，取容量瓶中的樣液測吸光度。

計算公式：X=Y×V×n×100%/m，其中X代表樣品中總黃酮的含量，Y代表樣液中檢測的總黃酮濃度(mg/mL，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算而得)，V為樣液體積(mL)，n為稀釋倍數(shù)，m為樣品量(mg)。

2.2 正交試驗優(yōu)選提取工藝結(jié)果

為了獲得復(fù)方金盞銀盤藥浴包中總黃酮提取的最佳工藝，采用正交實驗法研究各因素及其水平組合對提取效果的影響。經(jīng)過多次試驗，最終確定影響提取效率最大的因素主要為料液比(A)、纖維素酶用量(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)4個因素，本實驗選用L9(34)正交試驗，以復(fù)方金盞銀盤藥浴包中總黃酮提取率為指標(biāo)，確定其提取最優(yōu)料液比、酶用量、溫度、時間。分別精密稱取復(fù)方金盞銀盤藥浴包原料8.000 g(精確至0.001 g)，置于燒杯中，按照表1對應(yīng)的因素水平進行實驗，結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交試驗因素水平

根據(jù)分析結(jié)果可知，復(fù)方金盞銀盤藥浴包提取工藝中，各個因素對總黃酮的提取效果影響程度各不相同，影響程度依次為C>A>B>D，其中提取溫度的影響對提取效果有統(tǒng)計學(xué)意義。綜合生產(chǎn)及使用的綜合情況，在復(fù)方金盞銀盤藥浴包提取工藝中最優(yōu)的方案是A3B1C3D2，即以料液比1∶40，纖維素酶用量0.008 g，提取溫度為60 ℃，提取時間40 min。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

注：F0.05(2，2)=19.0。

2.3 重復(fù)性試驗

取備用樣品6份各8 g，在最優(yōu)提取工藝方案A3B1C3D2(料液比1∶40，纖維素酶用量0.008 g，提取溫度為60 ℃，提取時間40 min)進行提取，過濾得總黃酮樣液，取樣液5 mL，100 mL定容，取容量瓶中的樣液在在510 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算各樣品的總黃酮含量和平均含量，見表4。結(jié)果顯示RSD=0.52%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 精密度試驗

取備用樣品8 g，按照料液比1∶40，纖維素酶用量0.024 g，提取溫度為40 ℃，提取60 min的工藝條件進行提取，過濾得總黃酮樣液，取樣液5 mL，100 mL定容，取容量瓶中的樣液在510 nm波長處重復(fù)測定6次，結(jié)果見表5。計算結(jié)果顯示6次總黃酮含量的RSD=0.71%，表明此方法具有良好的精密度。

表5 精密度試驗結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性試驗

取備用樣品8 g，按照料液比1∶20，纖維素酶用量0.008 g，提取溫度為40 ℃，提取時間20 min的工藝條件進行提取，過濾得總黃酮樣液，取樣液2.5 mL，100 mL定容，取容量瓶中的樣液每隔5 min在510 nm波長處測定吸光度，并計算總黃酮含量，見表6。結(jié)果顯示平均值為69.86 mg·g-1，RSD值為0.91%，表明被測試溶液在30 min內(nèi)基本穩(wěn)定。但考慮到吸光度隨時間的延長而下降，本實驗按照第四部《中國藥典》的方法取15 min測量吸光度值。

表6 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.6 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的容量瓶(正交實驗中1號瓶)中定容液(測定總黃酮含量0.086 8 mg/mL)樣品6份各10 mL，分別加入0.1 mg/mL的蘆丁對照品溶液3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL，在510 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算含量，并計算加樣回收率，見表7。

公式為：(C-A)/B×100%

其中A：樣品所含被檢測成分量；B：加入純品量；C：實測值。結(jié)果表明，采用UV法測定總黃酮含量的加樣回收率較高，平均回收率為98.14%，RSD=2.26%，因此該方法準(zhǔn)確度較高。

表7 加樣回收率實驗結(jié)果

3 討論

由于蘆丁和黃酮類化合物均是以2-苯基色原酮為母核，具有相同的吸光度測試性質(zhì)，因此在實驗中選用蘆丁作為對照品測定藥浴包中總黃酮的含量。

在本次正交設(shè)計實驗中，從提取總黃酮的含量可見，提取溫度對于提取效果影響最大，其次分別為料液比和纖維素酶用量，因此，綜合考慮提取效率、生產(chǎn)成本以及患者使用實際情況，確定最佳提取工藝為60 ℃時加入0.008 g纖維素酶，料液比1∶40，提取40 min。本實驗確定的提取工藝操作簡單、穩(wěn)定性好，適合于工業(yè)化生產(chǎn)和日?；颊呤褂?。