夏良萍，孫惠芳，王 丹，郭蘭芳*，湯 建

(1.江蘇大學(xué)附屬四院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001；2.江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

金絲桃苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護(hù)、抗抑郁、抗氧化、保肝、抗癌、降血糖以及保護(hù)心腦缺血損傷等藥理活性[1，2]，廣泛存在于薔薇科(如北山楂)、藤黃科(如貫葉連翹)等植物中[3]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)野生植物澤漆中富含金絲桃苷及其衍生物2″-O-沒食子?；鸾z桃苷(2″-O-galloyl hyperoside，HyG)[4]。一些含有沒食子?；蔚奶烊换衔?如：茶多酚)往往具有良好的抗氧化、神經(jīng)保護(hù)活性[5]。因此本課題組推斷，2"-O-沒食子酰基金絲桃苷可能具有良好的抗炎、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)等方面的藥理活性。在本研究中，本課題組利用細(xì)胞模型初步評(píng)價(jià)了此化合物的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；PC12低分化細(xì)胞株，由江蘇大學(xué)藥學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供；HEK 293T細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)ATCC；1640培養(yǎng)基和新生牛血清(NBCS)，購(gòu)自維森特生物技術(shù)(南京)有限公司；DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清(FBS)，購(gòu)自Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；TRAPEZE端粒酶試劑盒，購(gòu)自美國(guó)EMD millipore。2"-O-沒食子?；鸾z桃苷和對(duì)照藥物金絲桃苷為本實(shí)驗(yàn)室自制，純度>95%。

1.2 主要儀器

Sartorius電子天平；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Thermo Scientific)；酶標(biāo)儀(Spectra Max190，Molecular Device)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)。

1.3 化合物對(duì)NO釋放的影響

參照文獻(xiàn)將HyG用DMSO配置成 100 mM的儲(chǔ)備液[6]，使用時(shí)用含10% NBCS的1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。指數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞接種于96孔板中，5×104個(gè)/孔。待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定貼壁后分別加入終濃度為0.3、3、30 μM的待測(cè)樣品，孵育24 h棄上清后每孔加入20 μL MTT工作液(5 mg/mL)，37 ℃孵育3 h。除去上清，每孔加入DMSO (100 μL)輕搖振蕩使得實(shí)驗(yàn)孔底部紫色結(jié)晶溶解并均勻分布，酶標(biāo)儀570 nm測(cè)得吸光度(OD值)，計(jì)算細(xì)胞存活率。

RAW 264.7細(xì)胞接種于24孔板中，4×105個(gè)/孔。待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定貼壁后分別加入終濃度為0.3、3、30 μM的待測(cè)樣品，孵育12 h。棄去上清后加入150 μL的含LPS(終濃度1 μg/mL)的培養(yǎng)基，孵育12 h。取上清，離心，備用。

將NaNO2標(biāo)品用細(xì)胞培養(yǎng)液梯度稀釋至0、1、2、5、10、20、40、60、100 μM，加至96孔板中，50 μL/孔。再依次加入Griess Reagent Ⅰ和Ⅱ，反應(yīng)20 min后于酶標(biāo)儀540 nm檢測(cè)吸光度(OD值)。以NaNO2濃度梯度為X軸，OD值為Y軸，得回歸方程為Y= 0.004X-0.016，r=0.997，在1～100 μM范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO濃度。

1.4 HyG對(duì)魚藤酮致PC12損傷的保護(hù)作用

參照文獻(xiàn)將PC12細(xì)胞接種于96孔板中[2]，細(xì)胞密度1×104個(gè)/孔；37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去上清，加入終濃度為0.1、1、10、100 μM濃度的HyG孵育5 h。加入終濃度5 μM的魚藤酮共育24 h。棄去上清，加20 μL的MTT于37 ℃孵育3 h。棄去上清，每孔加入DMSO (100 μL)輕搖振蕩使得實(shí)驗(yàn)孔底部紫色結(jié)晶溶解并均勻分布，酶標(biāo)儀570 nm測(cè)得吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。

生長(zhǎng)期細(xì)胞占細(xì)胞培養(yǎng)瓶的80%時(shí)，按照細(xì)胞密度6×103個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)24 h。棄去上清，加入終濃度為0.3、1、3、10、30 (μg/mL)的濃度梯度的PSC孵育5 h。加入終濃度50 μM共育24 h。棄去上清，加20 μL的MTT于37℃孵育3 h。棄去上清，每孔加入DMSO (100 μL)輕搖振蕩使得實(shí)驗(yàn)孔底部紫色結(jié)晶溶解并均勻分布，酶標(biāo)儀570 nm測(cè)得吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 化合物對(duì)疊氮鈉致PC12損傷的保護(hù)作用

在此實(shí)驗(yàn)中采用25 mM疊氮鈉(NaN3)損傷PC12細(xì)胞，其他操作同“1.4”項(xiàng)。

1.6 化合物對(duì)端粒酶的作用

參照文獻(xiàn)將HEK 293T細(xì)胞接種于12孔板中[7]，置于37 ℃，5% CO2孵箱培養(yǎng)48 h，吸去培養(yǎng)液后D-PBS洗滌，再加入胰蛋白酶消化5 min。加入DMEM培養(yǎng)基混勻、轉(zhuǎn)移至離心管中。400 g離心5 min，吸去上清，D-PBS洗滌。細(xì)胞中加入含有蛋白酶的裂解液，混勻后置于冰上裂解30 min，于4 ℃，12 000 g下離心20 min。上清層轉(zhuǎn)移至小離心管(10 μL/管)中，干冰/乙醇冷凍后置于-80℃冰箱內(nèi)保存。TRAP實(shí)驗(yàn)參照TRAPEZE?端粒酶試劑盒操作說明進(jìn)行，測(cè)定HyG對(duì)端粒酶的調(diào)節(jié)活性(圖3A-D)。每個(gè)微型離心管中含有上述制備的裂解產(chǎn)物2 μL，藥物的終濃度分別為0.1、1、10 μM，陽(yáng)性對(duì)照組為1 μL的TSR8，空白組為0.1% DMSO。

1.7 數(shù)據(jù)分析處理

本次實(shí)驗(yàn)采用GraphPad Prism 7統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素和多因素變異比較分析(ANOVA)，各組數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HyG對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥的抑制作用

在細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)室中，HyG對(duì)RAW264.7細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒活性，說明細(xì)胞培養(yǎng)液中NO濃度降低是基于藥物對(duì)細(xì)胞中NO釋放的抑制。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)HyG對(duì)RAW264.7細(xì)胞中NO釋放具有一定的抑制作用，但作用強(qiáng)度均低于相同濃度的金絲桃苷(HyP)。

注：LPS：1 μg/mL；IND(陽(yáng)性對(duì)照藥吲哚美辛)：50 μM；##P<0.01，**P<0.01。

圖1 HyP和HyG對(duì)RAW264.7細(xì)胞中NO釋放的抑制作用

2.2 HyG對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響

在細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)室中，HyG對(duì)PC12細(xì)胞的自然增殖沒有明顯的抑制作用，說明化合物HyG對(duì)PC12細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒活性。

2.3 HyG對(duì)魚藤酮和疊氮鈉致PC12損傷的保護(hù)作用

HyG(0.3-30 μM)對(duì)疊氮鈉所致的PC12細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用(P<0.01)，其中30 μM濃度下?lián)p傷后的PC12細(xì)胞存活率較空白對(duì)照組高10.3%，3 μM濃度下HyG的保護(hù)作用略低于金絲桃苷(HyP)。在魚藤酮致PC12細(xì)胞損傷模型中，HyG也表現(xiàn)出濃度依賴性的保護(hù)作用，但和模型組(Rot組)相比并未表現(xiàn)出顯著差異。

注：Ctrl：空白對(duì)照組；Rot：(魚藤酮)5 μM；NaN3(疊氮鈉)：10 mM；HyP(金絲桃苷)： 3 μM；##P<0.01，**P<0.01。

2.4 端粒酶活性

金絲桃苷(HyP)和HyG在0.1、1.0、10 μM濃度下，對(duì)HEK293T細(xì)胞中的端粒酶具有一定程度的抑制作用，相對(duì)端粒酶活性分別降低12.0%、12.9%、22.6%(圖3C)和-1.7%、27.6%、49.4%(圖3D)。

注：DMSO：0.1%DMSO；△H：95 ℃加熱20 min。

3 討論

HyG具有一定程度的抗炎活性，但和金絲桃苷相比并未表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。HyG對(duì)疊氮鈉損傷的PC12細(xì)胞具有顯著保護(hù)作用，但在3 μM濃度下HyG作用強(qiáng)度略低于金絲桃苷，對(duì)魚藤酮損傷的PC12細(xì)胞損傷不敏感。端粒酶激活是細(xì)胞壽命延長(zhǎng)和保護(hù)的重要機(jī)制之一，但與預(yù)期的結(jié)果相反，HyG和對(duì)照藥金絲桃苷對(duì)HEK293T細(xì)胞中的端粒酶具有一定程度的抑制作用?？梢?，HyG的神經(jīng)保護(hù)活性不是基于對(duì)端粒酶的激活作用，可能與其他方面的機(jī)制，如抗氧化應(yīng)激等有關(guān)。在后續(xù)的工作中還需要進(jìn)一步的研究來闡明HyG的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。