廖曉虎，潘其麟，王曉曉，邱棟樑，李祥蘭，李茂森

(德陽市食品藥品安全檢驗(yàn)檢測中心，四川 德陽 618000)

復(fù)方丹參片由丹參、三七和冰片三味中藥組成，具有活血化瘀、理氣止痛的功效，可用于治療氣滯血瘀所致的胸痹、冠心病和心絞痛等疾病[1，2]。2015年版《中國藥典》以丹參酮IIA、丹酚酸B、三七總皂苷(人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re和三七皂苷R1的總量計(jì))作為復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制指標(biāo)[1]。丹參作為復(fù)方丹參片的君藥，來源于唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖[3]，以丹參酮類為代表的脂溶性成分是其主要有效成分，具有廣泛的藥理活性，根據(jù)其不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)分為丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮等[4，5]；復(fù)方丹參片中此類成分主要發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞免受心肌缺血再灌注損傷，改善心臟功能，促進(jìn)梗塞后心肌重構(gòu)等作用[9-11]。

中藥多成分的含量測定方法長期以來一直面臨著對(duì)照品、生產(chǎn)品分離難度大，單體不穩(wěn)定，貨源緊缺，價(jià)格昂貴等問題。一測多評(píng)法通過建立樣品中某一易得、穩(wěn)定、有效的典型成分與其他成分間的相對(duì)校正因子(fi/s)以計(jì)算其他成分的量，實(shí)現(xiàn)了多成分的同步測定[6-8]。目前，《中國藥典》2015年版已將同步測定法用于丹參藥材、咳特靈膠囊等藥物的多成分測定。本研究將丹參酮類的代表成分丹參酮ⅡA、15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I作為研究對(duì)象，以丹參酮ⅡA為內(nèi)標(biāo)，通過計(jì)算此成分與其余3個(gè)成分(15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I)間的相對(duì)校正因子，建立復(fù)方丹參片一測多評(píng)的方法，對(duì)復(fù)方丹參片進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行相關(guān)性分析，以期為復(fù)方丹參片的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與材料

UltiMate 3000型超高效液相色譜儀(美國)；Agilent 1260型超高效液相色譜儀(美國)；島津LC-2030液相色譜儀(日本)；METTLER TOLEDO XS205型電子天平(美國)；KQ-700DV型雙頻數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

色譜柱：TechMate C18-ST柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

15，16-二氫丹參酮I(批號(hào)：00020044-611)對(duì)照品由美國ChromaDex提供；隱丹參酮(批號(hào)為 110852-201807，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%)、丹參酮I(批號(hào)為110867-201607)和丹參酮IIA(批號(hào)為110766-201721，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%)對(duì)照品，均購自中國食品藥品檢定研究院。

乙腈、甲醇均為色譜純；乙醇、磷酸均為分析純；超純水由ULUP-IV-10T型超純水器(四川優(yōu)普超純科技有限公司)制備。103批次復(fù)方丹參片樣品均來自2018年四川省食品藥品監(jiān)督管理局藥品評(píng)價(jià)性抽樣，見表1。

2 方法

2.1 色譜條件

以Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)為色譜柱；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.02%磷酸，梯度洗脫(0～6 min，61% A；6～20 min，61%A～90% A；20～20.5 min，90% A～61%A；20.5～25 min，61% A)。流速1.0 mL/min；柱溫20 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長270 nm。在上述色譜條件下，4種成分的色譜峰分離度良好，見圖1。

注：1為15，16-二氫丹參酮I；2隱丹參酮；3丹參酮I；4丹參酮IIA

續(xù)表1 復(fù)方丹參片樣品信息與外標(biāo)法和一測多評(píng)測定丹參酮類成分的含量及綜合得分 (mg·g-1)

2.2 對(duì)照品溶液的制備及線性范圍考察

分別取15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA對(duì)照品各適量，精密稱定，置同一100 mL量瓶中；加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成混合對(duì)照品貯備液。分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得到這4種對(duì)照品的7個(gè)不同濃度的混合對(duì)照溶液。按擬定方法注入高效液相色譜儀，以峰面積和對(duì)應(yīng)濃度(μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸，得到各個(gè)成分的回歸方程。結(jié)果顯示，這4個(gè)成分在線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，見表2。

表2 藥效成分的線性回歸方程

2.3 供試液的制備

取復(fù)方丹參片10片(糖衣片除去糖衣)，研成細(xì)粉，取細(xì)粉約1 g，精密稱定，置于150 mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入25 mL甲醇，稱重，超聲(100 W，45 kHz)15 min，放冷，補(bǔ)足失重。0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度考察 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，測定這4種藥效成分的峰面積。15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的RSD均≤0.47%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性考察 取同一樣品的粉末，6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，測定這4種藥效成分的峰面積，并計(jì)算其含量。15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA含量的RSD均≤0.87%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取1份供試品溶液，于制樣后0、2、4、8、12、24、48 h按擬定方法進(jìn)樣，結(jié)果15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA峰面積的RSD分別為1.56%、0.97%、1.08%、0.62%(n= 7)。表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 回收率考察 精密稱取0.5 g已知這4種藥效成分含量的復(fù)方丹參片粉末6份，分別加入與樣品中這些藥效成分含量大致相當(dāng)?shù)膶?duì)照品貯備液，再按“2.3”項(xiàng)方法制備成供試品溶液，進(jìn)樣測定。15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的平均回收率分別為106.14%、101.47%、98.29%、102.08%(n=6)，其RSD分別為4.06%、1.30%、1.24%、2.03%，表明所建立的方法準(zhǔn)確性良好。

2.5 樣品含量的測定

稱取每份復(fù)方丹參片樣品的粉末2份，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，再按“2.1”色譜條件測定這4種藥效成分的峰面積。根據(jù)回歸方程計(jì)算這4種藥效成分在供試品中的含量(mg·g-1)，結(jié)果見表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 一測多評(píng)質(zhì)量評(píng)價(jià)模式的建立

3.1.1 相對(duì)校正因子的計(jì)算 目前，對(duì)fi/s的計(jì)算多采用多點(diǎn)校正法和斜率校正法，這2種算法在計(jì)算過程中略有差異。多點(diǎn)校正法通過公式fi/s=(Ai/Ci)/(As/Cs)計(jì)算各成分的fi/s，式中Ai為待測成分i的峰面積，As為內(nèi)參物s的峰面積，Ci為待測成分的濃度或質(zhì)量，Cs為內(nèi)參物的濃度或質(zhì)量。樣品中待測成分量的計(jì)算公式為Ci′=Cs′Ai′/(fi/sAs′)，式中Ai′為樣品中待測成分i的峰面積，As′為樣品中內(nèi)參物s的峰面積，Ci′為樣品中待測成分i的濃度或質(zhì)量，Cs′為樣品中內(nèi)參物s的濃度或質(zhì)量[6]。在待測成分標(biāo)準(zhǔn)曲線A=aC+b中，采用斜率校正法計(jì)算fi/s，公式為fi/s=ai/as，式中ai為待測成分i斜率，as為內(nèi)參物s斜率。樣品中待測成分量的計(jì)算公式為Ci′=Ai′/(fi/sas)，式中Ai′為樣品中待測成分i的峰面積，Ci′為樣品中待測成分i的質(zhì)量[7，8]。

本實(shí)驗(yàn)以丹參酮IIA為內(nèi)參物，比較了在島津LC-2030色譜儀與waters Symmetry C18色譜柱條件下2種不同算法對(duì)fi/s的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種算法計(jì)算結(jié)果無顯著性差異，見表3。考慮到斜率校正無需逐個(gè)濃度計(jì)算平均fi/s，且在樣品指標(biāo)成分量計(jì)算過程中更為簡便，因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用斜率校正法建立的fi/s進(jìn)行計(jì)算。

表3 不同計(jì)算方法得到的fi/s

3.1.2 校正因子耐用性考察 本研究考察了Aglient 1260、UltiMate 3000和島津LC-2030這3種不同高效液相色譜系統(tǒng)和3種不同品牌、同類填料的色譜柱TechMate C18-ST柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm)、Waters Symmetry C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)、Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，結(jié)果見表4、表5。RSD均小于3.0%，說明不同色譜柱對(duì)待測成分校正因子無顯著影響；相對(duì)校正因子在使用不同儀器時(shí)的耐用性較好。

表4 不同色譜系統(tǒng)下3個(gè)藥效成分的相對(duì)校正因子

此外，本研究還采用島津LC-2030高效液相色譜系統(tǒng)，Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，分別考察了不同流速(0.9、1.0、1.1 mL·min-1)和不同柱溫(18 ℃、20 ℃、22 ℃)對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表6、表7。RSD≤2.0%，說明流速和柱溫微小變化時(shí)，校正因子波動(dòng)較小，說明相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性良好。

表5 不同色譜柱3個(gè)藥效成分的相對(duì)校正因子

表6 不同體積流量對(duì)3個(gè)藥效成分的相對(duì)校正因子的影響

注：3個(gè)藥效成分分別相對(duì)于內(nèi)參物丹參酮IIA的校正因子。

表7 不同柱溫對(duì)3個(gè)藥效成分的相對(duì)校正因子的影響

注：3個(gè)藥效成分分別相對(duì)于內(nèi)參物丹參酮IIA的校正因子。

3.1.3 一測多評(píng)法待測色譜峰的定位 為了在僅采用丹參酮IIA為對(duì)照品時(shí)，能夠確認(rèn)丹參酮I、隱丹參酮和15，16-二氫丹參酮I色譜峰的位置，從而通過獲得的相對(duì)校正因子同時(shí)計(jì)算3種成分的量，達(dá)到一測多評(píng)的目的，本研究考察了采用不同儀器和色譜柱時(shí)丹參酮I、隱丹參酮和15，16-二氫丹參酮I色譜峰與丹參酮IIA色譜峰間的保留時(shí)間差和相對(duì)保留時(shí)間2個(gè)參數(shù)，結(jié)果見表8、表9。結(jié)果表明，其他待測成分與丹參酮IIA保留時(shí)間差的RSD在4.6%～9.5%之間，相對(duì)保留值的RSD在1.4%～2.0%之間?？梢姡c丹參酮IIA色譜峰的保留時(shí)間差和相對(duì)保留時(shí)間均可作為其他3個(gè)待測成分色譜峰的定位參數(shù)，相對(duì)保留時(shí)間較保留時(shí)間差的變異更小，所以可以采用相對(duì)保留時(shí)間作為色譜峰的定位。

表8 保留時(shí)間差考察結(jié)果

表9 相對(duì)保留時(shí)間考察結(jié)果

3.1.4 內(nèi)參物的選擇 以外標(biāo)法的測定結(jié)果(Ws)為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)一測多評(píng)法計(jì)算結(jié)果(Wf)的準(zhǔn)確性。試以15，16-二氫丹參酮I為內(nèi)參物，Ws/Wf在42.90% ～ 122.70%之間，各成分外標(biāo)法與一測多評(píng)法結(jié)果差異顯著；而以丹參酮IIA為內(nèi)參物，Ws/Wf在95.70% ～ 101.70%之間，結(jié)果令人滿意。加之丹參酮IIA作為丹參中含量較高的主要有效成分，且對(duì)照品較其他成分容易得到，故在本研究中選用丹參酮IIA為內(nèi)參物。

3.1.5 一測多評(píng)法與外標(biāo)法的比較 為了驗(yàn)證所建立的一測多評(píng)方法的準(zhǔn)確性，本研究比較外標(biāo)法測定結(jié)果與一測多評(píng)法計(jì)算結(jié)果，見表1。結(jié)果表明，根據(jù)得到的校正因子計(jì)算103份復(fù)方丹參片樣品中4個(gè)藥效成分的含量和外標(biāo)法計(jì)算得到的4個(gè)藥效成分的含量之間的RE(相對(duì)誤差)值均<5%，并且配對(duì)t檢驗(yàn)分析結(jié)果表明同一成分分別用兩種方法測定的含量之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。此外，采用外標(biāo)法與一測多評(píng)法所得含量的比值(Ws/Wf)評(píng)價(jià)一測多評(píng)法的準(zhǔn)確度，比值為95.70% ～ 101.70%，說明建立以丹參酮IIA為內(nèi)參物的一測多評(píng)法的準(zhǔn)確度與外標(biāo)法相當(dāng)。

3.2 復(fù)方丹參片的質(zhì)量評(píng)價(jià)

以丹參酮IIA為參照成分，一測多評(píng)法計(jì)算103份復(fù)方丹參片樣品中4種丹參酮類的含量，15，16-二氫丹參酮I含量為0.079～0.809 mg·g-1，平均值0.325 mg·g-1；隱丹參酮含量為0.307～2.017 mg·g-1，平均值為0.814 mg·g-1；丹參酮I的含量為0.229～3.138 mg·g-1，平均值為0.814 mg·g-1；丹參酮IIA的含量為0.620 ～2.982 mg·g-1，平均值為1.116 mg·g-1，4種丹參酮成分的總量(總丹參酮)為1.493～8.459 mg·g-1，平均值3.226 mg·g-1。結(jié)果可見，不同生產(chǎn)企業(yè)、批號(hào)復(fù)方丹參片的丹參酮類的含量參差不齊，說明市面上的復(fù)方丹參片存在質(zhì)量差異，這可能與原藥材的質(zhì)量、生產(chǎn)工藝等有關(guān)。丹參藥材的產(chǎn)地、采收、加工、炮制等對(duì)丹參酮類成分的影響較大，以四川中江、遼寧凌源和山東平邑所產(chǎn)的丹參中丹參酮含量最高；以3年生并且在10-11月采收的丹參中丹參酮類的含量較高；陰干及低溫烘干法(40～60 ℃)較曬干法有利于丹參酮的保留；“發(fā)汗”能提高丹參酮類的含量；丹參藥材直徑越細(xì)，丹參酮類的含量越高；丹參酒炙，15，16-二氫丹參酮I、丹參酮IIA和丹參酮I的含量升高，隱丹參酮含量降低。在生產(chǎn)工藝方面，丹參提取物的提取時(shí)間、提取溶劑和濃縮溫度都會(huì)影響丹參酮的含量[12-16]。

3.3 主成分分析與曲線估計(jì)

把103批復(fù)方丹參片的15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA含量數(shù)據(jù)輸入SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，設(shè)置提取因子數(shù)目為4，進(jìn)行主成分分析，得到4個(gè)主成分得分變量(F1、F2、F3、F4)。4個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別為63.614%、25.002%、7.862%和3.522%，以各主成分因子得分與對(duì)應(yīng)方差貢獻(xiàn)率的乘積之和計(jì)算各個(gè)體的綜合模型函數(shù)。表達(dá)式C有效成分= 0.63614F1+ 0.25002F2+0.07862F3+ 0.03522F4，計(jì)算得到每份復(fù)方丹參片樣品的綜合得分值，詳見表1。

研究15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA、總丹參酮與綜合指標(biāo)之間的關(guān)系有可能不是簡單的線性關(guān)系，為此，本研究選擇多種曲線模型對(duì)15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA、總丹參酮與綜合指標(biāo)之間的關(guān)系進(jìn)行初步估計(jì)。在SPSS22.0軟件中選擇曲線估計(jì)，以主成分分析的綜合得分值為因變量，15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA、總丹參酮分別為自變量，選擇線性、對(duì)數(shù)、倒數(shù)、二次、三次、復(fù)合、冪、S、增長、增長、指數(shù)、Logistic 12種曲線擬合模型進(jìn)行曲線估計(jì)。模型R2值越大，表示模型估計(jì)越準(zhǔn)確。結(jié)果表明，15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA、丹參酮總和的擬合效果，均通過可靠性檢查(P< 0.01)。在12種曲線擬合模型中(圖2)，有效成分均為二次、三次方程的擬合效果最好；另外，丹參酮IIA的線性擬合效果也好，見表10。根據(jù)以上結(jié)果可知，15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA、總丹參酮與主成分分析的綜合得分值呈正相關(guān)，并且總丹參酮的擬合效果最好，相關(guān)性最強(qiáng)。

注：a、b、c、d、e、f分別為15，16二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA、丹參酮總和與綜合指標(biāo)的12種擬合曲線

表10 15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA、丹參酮總和與綜合指標(biāo)的曲線估計(jì)

丹參酮類具有顯著的心腦血管保護(hù)作用和抗腫瘤作用及抗菌、抗炎等多種藥理作用[4]。丹參酮IIA是丹參酮類化合物最有代表性的有效成分，在心腦血管疾病方面具有很好的療效，主要用于治療局部缺血或動(dòng)脈粥樣硬化疾??；15，16-二氫丹參酮I具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、保護(hù)肝臟的作用；隱丹參酮在抗腫瘤方面具有突出的作用；丹參酮I等具有神經(jīng)保護(hù)作用，可用于阿爾茨海默病的預(yù)防與治療[17-20]。說明這4種丹參酮類成分都有其特定的藥理作用。由于丹參酮中的成分復(fù)雜，不同成分之間也可能會(huì)存在相互作用。在體內(nèi)代謝過程中，丹參酮具有協(xié)同作用和代謝轉(zhuǎn)化作用。丹參酮提取物中的其他組分協(xié)同促進(jìn)丹參酮IIA在動(dòng)物體內(nèi)的吸收，同時(shí)促進(jìn)隱丹參酮代謝轉(zhuǎn)化為丹參酮IIA；丹參酮IIA在大鼠體內(nèi)可代謝產(chǎn)生丹參酮IIB[21-22]。

從多指標(biāo)的評(píng)價(jià)角度出發(fā)，總丹參酮與綜合指標(biāo)的一致性較好，相關(guān)性最強(qiáng)，說明單一的丹參酮IIA或隱丹參酮含量還是難以反映復(fù)方丹參片的質(zhì)量，而以總丹參酮最好。提示我們需要從整體的角度出發(fā)，研究各個(gè)指標(biāo)之間的相關(guān)性，才能更好地明確復(fù)方丹參片的藥效基礎(chǔ)，更好地為質(zhì)量評(píng)價(jià)服務(wù)。

4 結(jié)論

本研究利用丹參酮類成分化學(xué)結(jié)構(gòu)的相似性，建立了以1種成分為參照計(jì)算復(fù)方丹參片中4種丹參酮成分含量的一測多評(píng)法。采用方差分析，結(jié)果表明所建立的復(fù)方丹參片丹參酮類的一測多評(píng)含量測定方法與外標(biāo)法的測定結(jié)果無顯著性差異。本研究采用校正因子法從量上闡明了復(fù)方丹參片中丹參酮類成分間的相互關(guān)系，建立的相對(duì)校正因子具有較好的可信度，方法簡單、快速、準(zhǔn)確，可以實(shí)現(xiàn)在缺少對(duì)照品的情況下對(duì)復(fù)方丹參片丹參酮類成分的含量測定。

本研究運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)中的主成分分析及曲線估計(jì)法對(duì)丹參酮類的含量與復(fù)方丹參片的質(zhì)量進(jìn)行相關(guān)性分析?？偟⑼c主成分分析的綜合得分值呈正相關(guān)，并且總丹參酮的擬合效果最好，相關(guān)性最強(qiáng)。