張琪其，楊曉筱，羅仕艷，王慶學(xué)

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025)

傳統(tǒng)中醫(yī)將因不合理的飲酒而產(chǎn)生的身體傷害稱(chēng)為“酒傷”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，“酒傷”涵蓋了由于飲酒不當(dāng)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生的多系統(tǒng)疾病[1]。其在生殖系統(tǒng)主要表現(xiàn)為ED，即陰莖持續(xù)不能達(dá)到或維持足夠的勃起進(jìn)行滿(mǎn)意性交達(dá)3個(gè)月以上，且隨當(dāng)代社會(huì)人群飲酒量的增加，其發(fā)病率日益增加，對(duì)患者身心健康都有很大的負(fù)面影響。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前中國(guó)40歲以上男性ED的患病率約為40.56%[2]。預(yù)計(jì)全球在2025年約有3.22億ED患者[3]，酒傷所致ED將占相當(dāng)比重。ED的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中陰莖海綿體平滑肌(corp-us cavernosum smooth muscle，CCSM)結(jié)構(gòu)與功能不健全是其發(fā)生的一個(gè)重要因素。陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞(CCSMCs)是構(gòu)成CCSM的基本單位，也是保障CCSM結(jié)構(gòu)與功能健全的基本單位。陰莖的勃起依賴(lài)CCSMCs快速協(xié)同一致興奮舒縮而產(chǎn)生，縫隙連接(gap junction，GJ)被認(rèn)為是維持這種整體協(xié)調(diào)性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，構(gòu)成陰莖海綿體平滑肌縫隙連接的主要連接蛋白是連接蛋白43(connexin43，Cx43)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，Cx43基因與蛋白的表達(dá)可明顯被β-catenin干預(yù)[5]。β-catenin在機(jī)體多種組織細(xì)胞中均有表達(dá)，如平滑肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，既可作為一種細(xì)胞骨架蛋白存在于細(xì)胞膜，同時(shí)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中也有表達(dá)?？赏ㄟ^(guò)介導(dǎo)細(xì)胞間黏附、以轉(zhuǎn)錄因子形式調(diào)控基因與蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和調(diào)亡[6]。經(jīng)典解酒方——葛根散有防治飲酒過(guò)度所造成的酒毒內(nèi)蘊(yùn)之功效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，此方在治療酒傷大鼠ED方面亦有較為明顯的效果，可以顯著增加酒傷雄性大鼠追逐雌性大鼠次數(shù)、預(yù)防或修復(fù)酒傷大鼠睪丸組織病理?yè)p傷[7]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討葛根散對(duì)酒傷ED大鼠陰莖平滑肌組織β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步了解葛根散治療酒傷ED的具體作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療酒傷ED提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)SD雄性大鼠35只，體重(180±20)g，購(gòu)自貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCX(黔)20020001)]。

1.2 主要試劑與儀器

56%紅星二鍋頭白酒(北京紅星股份有限公司，批號(hào)100809)；Animal Total RNA lsolation Kit(FOREGENE公司，批號(hào)RE-03014)；RT EasyTM II(First-strand cDNA synthesis for Real Time PCR)(FOREGENE公司，批號(hào)RT-01023)；Real Time PCR EasyTM(FOREGENE公司，批號(hào)QP-01014)；ZS-2型板式酶標(biāo)儀(北京市新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司)BCA蛋白定量試劑盒(江蘇康為世紀(jì)公司，批號(hào)：CW0014)；PIKORed 96型實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x(型號(hào)：RT-PCR，美國(guó)ThermoFisher儀器有限公司)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(江蘇康為世紀(jì)公司，批號(hào)：CW0022)；Wester blotting ladder pen(江蘇康為世紀(jì)公司，批號(hào)：CW2502)；ECL高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(江蘇康為世紀(jì)公司，批號(hào)：CW0049)；EPS-300型電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System蛋白電泳槽(美國(guó)BIO-RAD公司)；Mini Trans-Blot蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)；抗β-Actin鼠單克隆抗體(江蘇康為世紀(jì)生物公司，批號(hào)：CW0096A)；抗β-Actin兔多克隆抗體(江蘇康為世紀(jì)生物公司，批號(hào)：CW0097A)；β-catenin(美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)：51067-2-AP)；ChemiDocTM XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥材

葛根散(金·張子和《儒門(mén)事親》)：由葛花、甘草、葛根、砂仁、貫眾等組成。組方藥材購(gòu)自貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，按原方比例常規(guī)制備水煎劑(調(diào)整生藥濃度為1 g·mL-1)備用。

1.4 動(dòng)物分組、造模及給藥

健康清潔級(jí)雄性SD大鼠，共35只，每組7只，隨機(jī)分成5組，即：空白組，模型組，葛根散低、中、高劑量組(0.05 g·10 g-1、0.1 g·10 g-1、0.2 g·10 g-1)。空白組以等量生理鹽水灌胃，模型組和葛根散低、中、高劑量組以紅星二鍋頭白酒按1.5 mL·100 g-1·d-1灌胃。每天灌酒30 min后，葛根散低劑量組、葛根散中劑量組、葛根散高劑量組以不同濃度的葛根散水煎劑灌胃，空白組和模型組代以等量生理鹽水，連續(xù)30 d。最后一次灌胃2 h后，處死并摘取大鼠陰莖。

1.5 RT-PCR法檢測(cè)葛根散對(duì)酒傷ED大鼠陰莖平滑肌組織β-catenin mRNA表達(dá)的影響

按照超純RNA試劑盒說(shuō)明從大鼠陰莖平滑肌組織制備總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和純度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，按cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性30s，95 ℃變性5s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)次數(shù)45個(gè)。目的基因作為引物和以GAPDH作為內(nèi)參基因，引物列為GAPDH，上游引物序列5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′，下游引物序列5′-CCACCCTGTTGCTGTAGCCATA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度270bp；β-catenin上游引物序列5′-GCCAGTGGATTCCGTACTG-3′，下游引物序列5′-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度202bp。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，擴(kuò)增結(jié)束后計(jì)算擴(kuò)增效率，并計(jì)算β-catenin基因的相對(duì)表達(dá)水平

1.6 Western Blot法檢測(cè)葛根散對(duì)酒傷ED大鼠陰莖平滑肌組織β-catenin蛋白表達(dá)的影響

按組織蛋白提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白提取，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將制備好的蛋白樣品加入10%的凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜，取膜，將其加入封閉液中，保持20 min，用蒸餾水將一步法試劑盒中的10×洗液稀釋成1×洗液；取二抗HRP至4 mL離心管中，再取一抗與二抗混勻，室溫孵育5 min，加入一步法抗體稀釋液。其中，一抗β-catenin濃度(1∶1 000)，二抗β-catenin濃度(1∶200)，一抗內(nèi)參β-actin濃度(1∶5 000)，二抗內(nèi)參β-actin濃度(1∶200)，傾去抗體混合液，用洗液漂洗3次，5 mL×5 min。ECL顯色曝光，分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR法檢測(cè)葛根散對(duì)酒傷ED大鼠陰莖平滑肌組織β-catenin mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組β-catenin mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。與模型組比較，葛根散中、高劑量組β-catenin mRNA表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)。見(jiàn)表1。

組別濃度(g·10g-1)β-cateninmRNA正常組-1.08±0.05模型組-0.37±0.13*葛根散低劑量組0.050.49±0.15*葛根散中劑量組0.10.61±0.11*#葛根散高劑量組0.20.72±0.21*#

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.2 Western Blot法檢測(cè)葛根散對(duì)酒傷ED大鼠陰莖平滑肌組織β-catenin蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。與模型組比較，葛根散低、中、高劑量組β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)。且葛根散高劑量組β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)水平與正常組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2、圖1。

組別濃度(g·10g-1)β-catenin蛋白正常組-0.73±0.10模型組-0.24±0.03*葛根散低劑量組0.050.36±0.06*#葛根散中劑量組0.10.46±0.05*#葛根散高劑量組0.20.53±0.09#

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

注：A正常組；B模型組；C葛根散低劑量組；D葛根散中劑量組；E葛根散高劑量組

圖1 葛根散對(duì)酒傷ED大鼠陰莖平滑肌
組織β-catenin蛋白條帶

3 討論

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展及生活方式的變化，我國(guó)成年男性人群ED發(fā)病率持續(xù)升高[8]。CCSM是維持陰莖勃起的重要結(jié)構(gòu)，研究表明，當(dāng)CCSM舒張時(shí)，血液灌注、回流受阻，陰莖勃起；當(dāng)CCSM收縮時(shí)，血液回流，陰莖處于松弛狀態(tài)。組成CCSM的CCSMCs作為保障CCSM結(jié)構(gòu)與功能的基本單位，其增殖、分化和凋亡對(duì)陰莖能否正常勃起有重要意義。Cx43是CCSMC細(xì)胞之間信號(hào)通訊的主要連接蛋白[9，10]，是CCSMCs相鄰細(xì)胞信息交流的主要通道，對(duì)協(xié)調(diào)CCSMC同步舒縮意義重大。而β-catenin廣泛存在于各種類(lèi)型的細(xì)胞中，由CTNNBl基因編碼，參與細(xì)胞間蛋白的轉(zhuǎn)錄及活性的調(diào)控。當(dāng)受到細(xì)胞因子激活后，β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞間蛋白隨β-catenin的表達(dá)增多而增多。有研究表明，β-catenin還具有促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化之功效，如促血管平滑肌細(xì)胞增殖[11]。

葛根散出自金代張子和所著《儒門(mén)事親》，由葛花、甘草、葛根、砂仁、貫眾組成，有利濕健脾、散毒解酒的功效[12]。葛根散主治飲酒過(guò)度、酒毒內(nèi)蘊(yùn)者，即從根本上清除酒熱濕毒，補(bǔ)益肝腎?，F(xiàn)代藥理研究表明，此方劑中葛花所含成分皂角苷具備氧化還原的作用，可以促進(jìn)乙醇氧化而保護(hù)胃腸黏膜，同時(shí)減緩酒精吸收入血而降低酒精濃度[13]。此方劑酒前服用或酒后服用均有效，可有效緩解因飲酒不當(dāng)導(dǎo)致的不適癥狀。

前期研究發(fā)現(xiàn)葛根散可以減輕或修復(fù)酒傷大鼠睪丸組織病理?yè)p傷，可以在一定程度上改善雄性酒傷大鼠的性欲[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著下降。與模型組比較，葛根散中、高劑量組β-catenin mRNA表達(dá)水平顯著上升，葛根散低、中、高劑量組β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著上升。且葛根散高劑量組β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)水平與正常組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，葛根散治療酒傷ED的機(jī)制之一可能與上調(diào)β-catenin mRNA及蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而提高Cx43蛋白表達(dá)水平有關(guān)[14]。加強(qiáng)CCSMCs細(xì)胞間聯(lián)系，為酒傷ED患者的臨床治療提供了理論依據(jù)。β-catenin是否能促進(jìn)CCSMCs增殖與分化，通過(guò)增加CCSMCs細(xì)胞數(shù)量以改善陰莖勃起功能，還有待于進(jìn)一步研究。