董玉君，卞 鏑

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847)

2型糖尿病(Diabetic Mellitus，DM)是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，而糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病最常見和最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致慢性腎衰竭甚至死亡的主要因素。其病理改變早期以腎臟肥大為特征，隨著病情的進(jìn)一步發(fā)展，則會(huì)出現(xiàn)以腎小球系膜區(qū)為主的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracelluar Matrix，ECM)積聚和系膜基質(zhì)增生，終致彌漫性和結(jié)節(jié)性腎小球硬化。因此，糖尿病腎損害的早期防治尤為重要。但目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)除了降糖以外，延緩DN的病情發(fā)展尚無有效方法。本實(shí)驗(yàn)研究旨在觀察中藥內(nèi)外治結(jié)合對(duì)模型大鼠早期腎組織中TGF-β1含量的影響，探討對(duì)DN是否有積極干預(yù)作用，為臨床防治DN提供一定理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠50只，體重(250±20)g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物一般狀態(tài)良好，皮毛光澤，進(jìn)食與活動(dòng)正常。

1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境及飼料

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室內(nèi)通風(fēng)及光線良好，濕溫度適宜。普通飼料配方為40%玉米面、26%白面、10%麩子等。高糖高脂飼料配方為61.5%普通飼料、10%豬油等，由沈陽前民飼料廠提供。

1.3 藥物

內(nèi)服藥物(金匱腎氣丸和五子衍宗丸加減)：由熟地、山藥、附子、菟絲子、覆盆子等藥物組成，購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥局，按成人劑量的7倍，水煎濃縮至2 mL，每1 mL含生藥2 g，每日1次灌胃，4 ℃冰箱貯藏備用，1周為1個(gè)療程，連續(xù)2個(gè)療程。

外治藥物：以丁香、附子、肉桂等為主。將藥物打成粉末，用黃酒調(diào)后敷灸神闕，藥物現(xiàn)用現(xiàn)配，1周為1個(gè)療程，連續(xù)2個(gè)療程。

1.4 主要儀器及試劑

鏈脲佐菌素(STZ；美國Sigma公司)；血糖測定分析儀(強(qiáng)生One toughⅡ)；Western blot檢測試劑盒、蛋白質(zhì)maker兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體(武漢博士德生物工程公司)；電泳槽、轉(zhuǎn)印槽(北京六一儀器廠)；電泳凝膠成像系統(tǒng)(美國)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 糖尿病腎損害動(dòng)物模型建立

雄性Wistar大鼠50只，隨機(jī)選取10只為空白對(duì)照組，予以普通飼料，其余大鼠喂以高糖高脂飼料。喂養(yǎng)4周，造模組大鼠體重達(dá)到(340±10)g(其中有4只體重未達(dá)標(biāo)者從實(shí)驗(yàn)中剔除)，按50 mg/kg的劑量腹腔注射STZ溶液。72 h后測空腹血糖≥16.7 mmol/L且血糖穩(wěn)定，繼續(xù)喂養(yǎng)12周，并于眶靜脈取血，檢測Sur和BUN含量，與空白對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即DM腎損害大鼠造模成功(造模期間有5只大鼠死亡，3只大鼠血糖偏低剔除)。

2.2 動(dòng)物分組與給藥方法

將成模的28只大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、內(nèi)治組、外治組、內(nèi)外治結(jié)合組，每組7只，在成模后2周進(jìn)行2個(gè)療程的治療。實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，不使用胰島素及其他降糖藥物。內(nèi)治組和內(nèi)外治結(jié)合組按人體-大鼠體表面積比值換算按中等劑量4.8 kg·d-1進(jìn)行灌胃。等量選取敷灸藥物用黃酒調(diào)勻，用于外治組和內(nèi)外治結(jié)合組敷灸神闕。

大鼠神闕穴的定位：大鼠的腹正中線上，以劍突為一定位點(diǎn)，以外生殖器為另一定位點(diǎn)，兩者連線的上2/3與下1/3的交點(diǎn)(參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》)。

2.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的記錄與測定

2.3.1 取材 大鼠禁食不禁水12 h，檢測血糖值后用7%的水合氯醛0.5 mL/100 g腹腔注射深麻醉后置于解剖臺(tái)上，取仰臥位，于腹部切開皮膚，剝離腹腔臟器，露出腹主動(dòng)脈，行腹主動(dòng)脈穿刺取血。處死大鼠后剝離并迅速摘取腎臟，濾紙吸去臟器表面血液，去除包膜，稱重，置于EP管中，冷凍保存。

2.3.2 Western blot檢測TGF-β1 取腎組織100 mg裂解離心后取每個(gè)樣本的10 μg進(jìn)行凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，先后分別加入一抗(1∶1 000)和二抗(1∶2 000)進(jìn)行孵育，滴入ECL發(fā)光液，曝光采集圖像。以β-actin為內(nèi)參照，采用凝膠成像分析軟件測定各條帶灰度值，并以目的蛋白灰度值/內(nèi)參條帶灰度值的比值作為TGF-β1相對(duì)表達(dá)水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠腎重/體重比較

模型組及各治療組大鼠腎重/體重比值與空白對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明大鼠腎臟出現(xiàn)病理性改變。治療組大鼠腎重/體重比值與模型對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各種治療方法均有一定的效果。內(nèi)治組和外治組大鼠腎重/體重比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但內(nèi)外治結(jié)合組大鼠腎重/體重比值明顯優(yōu)于內(nèi)治組和外治組(P<0.05)。見表1。

組別腎重/體重(×10-3)空白對(duì)照組6.93±0.35模型對(duì)照組14.58±1.58*內(nèi)治組11.10±0.83*△★☆外治組11.37±1.49*△★☆內(nèi)外治結(jié)合組10.37±0.83*△

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與內(nèi)外治結(jié)合組比較，★P<0.05，內(nèi)治組與外治組比較，☆P>0.05。

3.2 各組大鼠腎組織中TGF-β1表達(dá)情況比較

造模組大鼠TGF-β1表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)，模型對(duì)照組大鼠TGF-β1表達(dá)水平顯著高于各干預(yù)治療組別(P<0.01)，內(nèi)治組和外治組大鼠TGF-β1表達(dá)水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但內(nèi)外治結(jié)合組大鼠TGF-β1的表達(dá)水平明顯優(yōu)于內(nèi)治組和外治組(P<0.01)。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)情況

組別TGF-β1空白對(duì)照組0.185±0.022模型對(duì)照組0.594±0.078*內(nèi)治組0.428±0.028*△★☆外治組0.419±0.057*△★☆內(nèi)外治結(jié)合組0.301±0.052*△

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01；與內(nèi)外治結(jié)合組比較，★P<0.01，內(nèi)治組與外治組比較，☆P>0.05。

4 討論

4.1 動(dòng)物模型的建立

文獻(xiàn)[1-2]表明，STZ對(duì)胰島β細(xì)胞有選擇性破壞作用，結(jié)合高糖高脂飼料喂養(yǎng)能誘發(fā)大鼠產(chǎn)生廣泛性胰島素抵抗，且雄性大鼠制造模型的成模率明顯高于雌性大鼠。故采用該方法復(fù)制的動(dòng)物模型符合人類2型DM的發(fā)病特點(diǎn)。3～6月齡大鼠相當(dāng)于人的青春期階段，而大鼠產(chǎn)生高血糖后又進(jìn)行喂養(yǎng)3個(gè)月，此時(shí)大鼠年齡相當(dāng)于人的中年期[3]。經(jīng)歷了漫長的疾病階段，以方測證[4]并結(jié)合大鼠的嗜睡、倦臥、尿頻清等癥狀綜合分析，已發(fā)展為最終的腎陽虛階段。

4.2 中醫(yī)理論依據(jù)

內(nèi)服藥物以金匱腎氣丸和五子衍宗丸加減而成，旨在扶正以祛邪，其中金匱腎氣丸具有補(bǔ)腎氣、溫腎陽的功效。方中加入少量具有溫通經(jīng)脈的桂枝等，在于取“少火生氣”之義[5-6]。五子衍宗丸為補(bǔ)腎益精經(jīng)典方劑，方中菟絲子補(bǔ)肝腎益精，覆盆子助君藥滋腎澀精。

神闕為任脈穴，位于腹中部臍中央，毗鄰脾、胃、膽、大腸和小腸等多個(gè)與飲食運(yùn)化相關(guān)臟腑，脾胃又為氣機(jī)升降之樞紐。同時(shí)臍部內(nèi)分布的多種植物神經(jīng)叢和神經(jīng)節(jié)，其支配著腹部盆腔內(nèi)所有臟腑器官和血管[7]，因此神闕與運(yùn)化食物水飲和氣機(jī)升降出入都有著緊密的聯(lián)系。臍又是母體與胎兒聯(lián)系的樞紐，同時(shí)神闕與丹田相通，所以神闕為五臟六腑之根，是先天真息潛藏的主要部位，與人體生命活動(dòng)密不可分。

吳氏[8]認(rèn)為內(nèi)治與外治有殊途同歸之理，在上述理論的指導(dǎo)下，結(jié)合DN遷延日久腎陽虛損的病機(jī)特點(diǎn)，以具有溫補(bǔ)腎陽作用的附子、肉桂等藥物外敷神闕穴，藥物通過臍穴皮膚的滲透吸收進(jìn)入血液，推動(dòng)氣血運(yùn)行，改善局部微循環(huán)。

4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論

DN發(fā)病過程中，ECM逐漸增加，與體內(nèi)多種細(xì)胞因子參與有關(guān)，其中最重要的因子是致纖維化因子TGF-β1。在生理狀態(tài)下，腎臟ECM合成與降解處于動(dòng)態(tài)平衡。在病理因素作用下，這種平衡被打破，其一為腎臟的ECM合成增多，其二為腎臟的ECM降解減少[7，9]。

Shankland及Nakamura[10-11]均發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中TGF-β1比正常大鼠含量高2.2～4倍。研究發(fā)現(xiàn)[12]，TGF-β1具有促進(jìn)糖尿病時(shí)腎臟肥大、提高基質(zhì)降解酶抑制物活性、抑制基質(zhì)降解酶的合成、致ECM的積聚增加和降解減少的作用，從而促進(jìn)腎小球硬化。TGF-β1的持續(xù)高度表達(dá)又可誘導(dǎo)包括系膜細(xì)胞在內(nèi)多種細(xì)胞的基質(zhì)蛋白，如IV膠原、纖維連接蛋白等。所以實(shí)驗(yàn)研究從降低糖尿病腎病時(shí)期TGF-β1的表達(dá)著手，探討并尋求有效的糖尿病腎病防治方法。

本研究觀察顯示，給予一定治療方法后腎重/體重比值及TGF-β1的表達(dá)有所下降，空白對(duì)照組大鼠腎組織中TGF-β1僅微弱表達(dá)，模型對(duì)照組大鼠的TGF-β1較空白對(duì)照組有顯著提高，與以上討論結(jié)果一致。各中藥治療組能顯著降低糖尿病大鼠腎皮質(zhì)TGF-β1的表達(dá)，但中藥內(nèi)治組與外治組別相比較無顯著性差異，其中結(jié)合法治療組療效優(yōu)于單純藥物內(nèi)服組或單純藥物外治組。由此我們推測降低TGF-β1的表達(dá)，減少腎臟細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，是中藥內(nèi)外治結(jié)合法防治DN的作用機(jī)理之一。

5 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用具有溫補(bǔ)腎陽、扶正祛邪作用的中藥內(nèi)服結(jié)合外治的治療方法可減輕腎臟肥大及腎小球基底膜增生、硬化，中藥內(nèi)外治結(jié)合法能夠防治大鼠糖尿病早期腎損害。本研究為臨床應(yīng)用溫補(bǔ)腎陽法防治糖尿病腎病提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。