張家林，林心君，周 勇，莊舒婷，施 紅

(福建中醫(yī)藥大學 中西醫(yī)結(jié)合學院，福建 福州 350121)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)的主要特點為碳水化合物、脂類和蛋白質(zhì)平衡失調(diào)，同時出現(xiàn)胰島素分泌受損、胰島素抵抗[1]。2型糖尿病是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的危險因素，該疾病包括肝脂肪變性(非酒精性脂肪肝，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、纖維化(HF)和肝硬化。許多前瞻性研究[2]表明，2型糖尿病和肝纖維化之間存在聯(lián)系。糖尿病的主要表現(xiàn)為高血糖，且越來越多研究表明其能明顯促進肝臟等器官纖維化的形成[3]。Ⅳ型膠原(ⅣC)與肝纖維化的程度關(guān)系密切，是構(gòu)成基底膜的成分，反映基底膜膠原更新率，在肝纖維化時最早出現(xiàn)，可較靈敏地反映肝纖維化過程，因此可作為早期診斷的指標[4]。NF-κB是介導炎癥的經(jīng)典通路，而肝纖維化主要由于炎癥介質(zhì)激活肝形狀細胞活化而形成。本文通過討論石斛合劑對NF-κB信號通路的影響，以研究石斛合劑對2型糖尿病合并肝纖維化的抑制作用，為2型糖尿病合并肝纖維化的治療提供新的理論依據(jù)。

石斛合劑(現(xiàn)為福建省第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑)序貫療法是施紅教授通過多年對糖尿病的臨床與基礎(chǔ)研究，不斷實踐與修正，總結(jié)出的獨特配方，臨床上常用于治療糖尿病及其并發(fā)癥。最新研究[5]表明，石斛合劑序貫法能夠有效改善2型糖尿病合并肝纖維化大鼠血糖，肝功能(ALT、AST)，血清肝纖維化四項(PC-Ⅲ、HA、Ⅳ-C、LN)，然而石斛合劑對2型糖尿病合并肝纖維化的作用機制不明。本文通過觀察2型糖尿病合并肝纖維化后的NF-κB信號表達，探討糖尿病合并肝纖維化的部分機制及石斛合劑的治療作用。

1 材料與試劑

1.1 動物

成年健康雄性SPF級Wistar大鼠40只，體重(200±10)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬)2012-00020，于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)。該實驗符合中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會要求。采用隨機數(shù)表法將40只Wistar大鼠隨機分為正常對照組和模型組，模型組采用高脂高糖6W+STZ(25 mg/kg)造模，而后按照血糖、體重隨機分為模型對照組、二甲雙胍組、石斛合劑組，每組8只。

1.2 藥材與試劑

石斛合劑1方：石斛、黃芪、丹參、五味子、知母、葛根、生地黃、地龍組成。石斛合劑2方：茵陳、梔子、滑石、大黃、萹蓄、甘草組成，購自福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院，加工成石斛合劑1方含生藥量1.7 g/mL，石斛合劑2方含生藥量1 g/mL，無菌保存于-20 ℃冰箱。一抗：兔抗大鼠IV型膠原抗體(購于Abcam，美國)、NF-κB P65(Cell Signaling Technology，美國)、NF-κB P50(Cell Signaling Technology，美國)、IκBβ(Cell Signaling Technology，美國)、IKKβ(Cell Signaling Technology，美國)、鼠抗β-actin抗體(Sigma，中國)、二抗：山羊抗兔、山羊抗鼠、鏈霉素抗生物蛋白-過氧化酶免疫組化試劑盒(購于碧云天生物技術(shù)研究所，中國)。

1.3 儀器

尼康生物顯微鏡(日本尼康公司，55I)；5417R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；電泳槽及轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；DU-650型蛋白分析儀(美國Beckman公司)。

2 方法

2.1 模型建立

根據(jù)課題組前期造模方法[5]，高脂飼料配方：60.7%基礎(chǔ)飼料、15%蔗糖、10%豬油、10%蛋黃粉、4%膽固醇、0.3%膽酸鹽，正常對照組予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，余大鼠予高脂飼料喂養(yǎng)6周后。隔夜禁食(12 h)，予1%的STZ(檸檬酸鈉緩沖液配制，pH=4.2～4.4)腹腔一次性注射(25 mg/kg)，續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。于注射后3天(72 h)后尾部采血測定血糖，若連續(xù)2次隨機血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠。按照體重、血糖分組后選取24只成模鼠，予40% CCL4(橄欖油配制)皮下注射(0.2 mL/100 g，2次/周，8周)，建立合并肝纖維化模型，并同時予相應藥物處置(見“2.2”項)。

2.2 干預方法

石斛合劑組給予石斛合劑1方灌胃7天，給藥劑量為17 g·kg-1·d-1，續(xù)給予石斛合劑2方灌胃3天，給藥劑量10 g·kg-1·d-1，循環(huán)灌胃，干預8周；二甲雙胍組給予二甲雙胍灌胃，給藥劑量為0.1 g·kg-1·d-1，干預8周；正常對照組、模型對照組給予等量0.9%NaCl溶液灌胃，干預8周。

2.3 取材

干預8周后，取材前隔夜禁食不禁水，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，剪開腹腔，腹主動脈采血，裝于抗凝真空采血管，并4 ℃離心制備血清，用于生化指標檢測。同時暴露肝臟，取出置于冰上，于預冷0.9%NaCl溶液中清洗，一部分0 ℃冰箱中保存行Western Blot檢測，余肝臟組織，用濾紙吸凈水分，置于4%多聚甲醛中固定，用于免疫組化檢測。

2.4 檢測方法

2.4.1 血清學檢測 尾部采血測量空腹血糖，離心制備的血清按試劑盒說明書測定AST、ALT。

2.4.2 免疫組化 肝臟組織石蠟切片(厚度4 μm)常規(guī)脫蠟、入水；PBS(磷酸鹽緩沖液)清洗，將玻片置于枸櫞酸鹽緩沖液微波輻射修復，自然冷卻到室溫；PBS沖洗5 min×3次；加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min；PBS沖洗5 min×3次，加封閉血清，37 ℃恒溫孵育1 h；甩去組織表面封閉液，濾紙吸去殘留血清；滴加兔抗大鼠IV型膠原一抗(1∶200)，4 ℃過夜。第2日，室溫復溫30 min，PBS沖洗5 min×3次，滴加羊抗兔二抗，37 ℃恒溫箱孵育30 min；PBS沖洗5 min×3次，滴加鏈霉素抗生物蛋白-過氧化酶，37 ℃恒溫箱孵育30 min；PBS沖洗5 min×3次，甩去PBS液，加2滴新鮮配制DAB染色液5 min，水洗，蘇木素復染，水洗，吹干，封片。采用尼康生物顯微鏡觀察。

2.4.3 Western blot檢測 每100 mg肝臟組織加入1 mL細胞裂解液和10 μL苯甲基硫酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，充分研磨，12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測蛋白濃度。采用5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl-polyacryl gradient gel electrophoresis，SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入NF-κB P65(1∶ 1 000)、NF-κB P50(1∶1 500)、IκBβ(1∶1 000)、IKKβ(1∶1 000)及β-actin(1∶ 1 000)一抗，4 ℃過夜。TBST洗膜×3，加入二抗(1∶2 000辣根過氧化物標記)，室溫孵育1 h，避光顯影成像。采用Image-lab軟件進行條帶分析處理，以β-actin為內(nèi)參。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠空腹血糖及血清肝功能指標比較

干預前，與正常對照組比較，模型對照組、二甲雙胍組、石斛合劑組大鼠空腹血糖均明顯升高(P<0.05)。干預后，與模型對照組比較，二甲雙胍組、石斛合劑組大鼠空腹血糖明顯降低(P<0.05)。與干預前比較，干預后二甲雙胍組、石斛合劑組大鼠空腹血糖水平明顯下降(P<0.05)。干預后，二甲雙胍組與石斛合劑組大鼠空腹血糖水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，以上結(jié)果說明石斛合劑能有效降低2型糖尿病合并肝纖維化大鼠血糖。見表1。

與正常對照組比較，模型對照組大鼠ALT、AST顯著升高，而二甲雙胍組、石斛合劑組大鼠ALT、AST輕微升(P<0.05)。與模型對照組比較，二甲雙胍組、石斛合劑組大鼠ALT、AST明顯下降(P<0.05)，二甲雙胍組與石斛合劑組大鼠AST比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示石斛合劑能有效改善2型糖尿病合并肝纖維化肝功能(ALT、AST)的情況。見表2。

組別例數(shù)(n)干預前(mmol/L)干預后(mmol/L)正常對照組84.7±0.275.32±0.25#模型對照組819.82±6.17*16.64±2.18*二甲雙胍組820.94±5.38*6.7±2.63#△石斛合劑組819.36±6.74*7.55±2.71#△

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與干預前比較，△P<0.05。

組別例數(shù)(n)ALT(U/L)AST(U/L)正常對照組853.81±6.3176.44±6.25模型對照組8166.48±4.368*283.65±15.45*二甲雙胍組898.44±12.95*#106.08±16.14*#石斛合劑組880.44±17.29*#106.71±15.81*#

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05。

3.2 肝組織Ⅳ型膠原(collagen-Ⅳ)免疫組化觀察

肝臟Ⅳ型膠原陽性表達反應呈淡黃色，主要分布在肝細胞外間質(zhì)，細胞核呈藍染。正常對照組大鼠可見極少Ⅳ型膠原陽性表達沉積在細胞外間質(zhì)，與正常對照組相比，模型對照組大鼠可見較多的Ⅳ型膠原陽性表達(P<0.05)。與模型對照組相比，二甲雙胍組、石斛合劑組大鼠Ⅳ型膠原陽性表達顯著減少(P<0.05)。見圖1。

圖1 肝臟免疫組化Ⅵ膠原表達情況

3.3 Western blot檢測NF-κB P65、NF-κB P50、IKKβ、IκBβ蛋白表達

與正常對照組相比，模型對照組大鼠NF-κBP65、NF-κBP50、IKKβ表達量顯著升高，IκBβ表達量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型對照組相比，二甲雙胍組、石斛合劑組大鼠NF-κBP65、NF-κBP50、IKKβ表達均顯著降低，IκBβ表達量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，# P<0.05。

4 討論

肝臟是胰島素攝取和作用的器官，胰島素能促進肝臟糖原的合成并減少糖異生，當胰島素抵抗時，脂肪組織分解成游離脂肪酸增加，同時肝臟糖原合成及骨骼肌對血糖的攝取作用降低，最終不僅引發(fā)血糖升高甚至糖尿病，也會出現(xiàn)脂肪異位。許多研究表明，血糖升高及糖尿病會促進神經(jīng)[6]、血管[7]、腎臟[8]纖維化及視網(wǎng)膜[9]發(fā)生病變。相關(guān)實驗證實高糖會引起肝星狀細胞活化增殖，促進肝纖維化[10]。

肝纖維化的特點為膠原纖維在肝細胞外間質(zhì)過度沉積，而膠原纖維主要由肝星狀細胞合成，高血糖被認為是一種炎癥前狀態(tài)，更容易激活肝星狀細胞，合成膠原纖維[3]。在高糖狀態(tài)下，許多炎癥細胞因子大量產(chǎn)生，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素1(IL-1)等，其能刺激肝星狀細胞活化，導致肝纖維化發(fā)生。在長期的高糖狀態(tài)下，蛋白質(zhì)在體內(nèi)容易反復糖基化，形成糖基化終末產(chǎn)物，從而與肝星狀細胞表面糖基化終末產(chǎn)物受體結(jié)合產(chǎn)生信號傳遞，促進一系列與肝纖維化發(fā)生有關(guān)因子產(chǎn)生，如血小板衍生生長因子(PDGF)、TGF-β等[17]。

中藥在治療糖尿病及糖尿病肝纖維化方面具有獨特的優(yōu)勢。許多現(xiàn)代研究表明石斛合劑中大部分藥物的提取物除了有明顯的降糖作用，還可改善肝臟炎性反應，防治肝纖維化。如石斛中的石斛多糖、黃芪中的黃芪總苷，均能提高大鼠抗氧化能力，減輕肝臟炎癥反應[11-12]。五味子提取物可減輕肝細胞過氧化損傷，改善肝功能，抑制肝膠原纖維形成[13]。葛根中的葛根素可減少炎癥因子的生成，緩解炎癥因子對肝組織損傷，抗纖維化形成[14]。丹參中的丹參酮可改善肝功能、抑制星狀細胞活化，減少細胞外基質(zhì)生成[15]。地龍?zhí)崛∥?、大黃中的大黃素可抑制肝組織形狀細胞活化，發(fā)揮抗纖維化作用[16]。本研究證實石斛合劑具有降糖、改善肝功能及抗肝纖維化作用，石斛合劑干預6周后大鼠血糖及ALT、AST明顯下降，通過電鏡肝臟HE染色及免疫組化觀察，可清晰觀察到石斛合劑能抑制肝臟Ⅳ膠原纖維的合成及對肝纖維化明顯的改善作用。

NF-κB是二聚體轉(zhuǎn)錄因子，其主要調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)功能。NF-κB通過入核與靶基因調(diào)節(jié)區(qū)中的κB序列結(jié)合而實現(xiàn)效用。哺乳動物的NF-κB二聚體通過2個Rel亞基的同源和異二聚體相互作用產(chǎn)生，分別由NF-κB1(編碼p50及前體p105)、NF-κB2(編碼P52及前體p100)、relA(編碼P65)、relB(編碼relB)及C-rel(編碼c-rel)基因表達，P65和p50二聚體通常是基因轉(zhuǎn)錄的激活因子。

通常，NF-κB二聚體與IκB(IκBα，IκBβ，IκBε)蛋白結(jié)合而以無活性狀態(tài)存在，其掩蓋核定位和NF-κB二聚體的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在各種細胞炎癥因子如TNF-α和IL家族等刺激下，NF-κB經(jīng)典途徑則被激活，從而導致P65和P50二聚體在核內(nèi)堆積，IκB在絲氨酸32和36位處磷酸化，這過程由IKK復合物催化。該復合物含有兩個催化亞基，IKKα和IKKβ及NF-κB調(diào)節(jié)亞基IKKγ，在經(jīng)典途徑中主要由IKKβ起作用。相關(guān)研究證實，NF-κB活化與肝星狀細胞(HSC)轉(zhuǎn)化成瘢痕形成的肝肌成纖維細胞有關(guān)，這也是纖維化反應的關(guān)鍵一步。本實驗中，Wester blot檢測顯示石斛合劑能降低IKKβ、NF-κB P50、NF-κB P65蛋白表達，提示石斛合劑可降低NF-κB信號表達。因此石斛合劑的作用機制之一為減少IKKβ蛋白表達，從而降低其下游NF-κB P50、NF-κB P65蛋白的活化，抑制NF-κB信號途徑，進而抑制肝臟膠原纖維的形成，改善肝纖維化，但是石斛合劑通過降低IKKβ信號抑制NF-κB信號通路的作用及其機制仍需進一步研究。