謝明仁, 管海彥, 盧建珍, 俞發(fā)榮

精神依賴(lài)物(海洛因)對(duì)胚胎大鼠形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育和小腦基因表達(dá)的影響

謝明仁, 管海彥, 盧建珍, 俞發(fā)榮*

甘肅政法大學(xué)公安技術(shù)學(xué)院，甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730070

為了探討精神依賴(lài)物海洛因?qū)ε咛ゴ笫笮螒B(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育和小腦表達(dá)的影響, 將受孕后的Wistar大鼠40只, 隨機(jī)分為對(duì)照組、海洛因低、中、高劑量組, 每組10只孕鼠。于第7天時(shí), 分別給予32.5、65 和130 mg·kg-1的海洛因, 連續(xù)9 d, 觀(guān)察該物對(duì)胚胎大鼠形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育的影響, 用免疫組化法檢測(cè)胚胎大鼠小腦組織基因表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 海洛因低、中劑量組活胚胎總數(shù)比對(duì)照組分別減少15.87%和29.37%;海洛因低、中劑量組出現(xiàn)了多指, 臍疝, 雙耳、肋骨、腰椎骨、前肢掌骨、腦發(fā)育不全等畸形胚胎; 高劑量組孕鼠未見(jiàn)成型的胚胎。海洛因低、中劑量組胚胎小腦皮層中表達(dá)水平(IOD)比對(duì)照組分別增加了48.94%和95.74%(<0.01)。結(jié)果表明, 精神依賴(lài)物海洛因能通過(guò)母體干擾胚胎表型和組織器官的發(fā)育, 誘導(dǎo)胚胎小腦組織細(xì)胞基因表達(dá), 損傷腦組織細(xì)胞的發(fā)育。

海洛因; 胚胎發(fā)育;

0 前言

精神依賴(lài)物(海洛因)濫用已成為嚴(yán)重危及人類(lèi)健康并為全球所關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。統(tǒng)計(jì)表明, 近年來(lái), 我國(guó)吸食毒品的人群中, 青少年呈快速上升趨勢(shì), 其中大多是15—30歲的青少年; 同時(shí), 女性吸毒人數(shù)呈上升趨勢(shì)[2], 約占全部吸毒者20%—30%, 她們多為育齡婦女或?qū)⒁M(jìn)入育齡期的婦女, 其平均年齡集中在育齡期范圍。海洛因在引起母體損傷的同時(shí), 可迅速通過(guò)胎盤(pán)屏障和胚胎血腦屏障, 對(duì)胎兒產(chǎn)生直接的影響[3]。有關(guān)精神依賴(lài)物(海洛因)對(duì)胚胎表型結(jié)構(gòu)發(fā)育及對(duì)小腦組織發(fā)育的毒性作用的報(bào)道較少。本文在前期研究的基礎(chǔ)上, 以Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 建立海洛因孕鼠模型, 在大鼠胚胎發(fā)育期給予不同劑量的海洛因, 觀(guān)察海洛因?qū)ε咛ゴ笫蠼M織器官發(fā)育和小腦皮質(zhì)中基因表達(dá)水平的影響, 以期為進(jìn)一步研究精神依賴(lài)物(海洛因)的遺傳毒性提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: 健康性成熟Wistar大鼠90只(雌60只, 雄30只), 體重200—210 ｇ, 購(gòu)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心[SCXK(甘)2015—0001], 實(shí)驗(yàn)在甘肅政法大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室完成[SYXK (甘)2015—0006]。實(shí)驗(yàn)按3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理關(guān)懷。

藥品: 海洛因, 含量86.8%, 其余成分為葡萄糖, 甘肅省公安廳提供; 2, 4, 6—三硝基酚、氫氧化鉀、甘油、水合氯醛、茜素紅、葡萄糖, 購(gòu)于甘肅省化玻試劑公司; OLYMPUS—CX31型生物顯微鏡(日本); YA—G5000系列醫(yī)學(xué)細(xì)胞影像分析軟件; 兔抗、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒, 購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司; EDTA液, 購(gòu)于北京中杉生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠培育、分組和給藥

全部大鼠適應(yīng)環(huán)境7 d, 按雌: 雄=2: 1合籠飼養(yǎng), 合籠后次日早晨作陰道精子涂片檢測(cè), 有精子者為已交配, 當(dāng)日作為“受孕”零天。將檢出的“孕鼠”隨機(jī)分為4組, 每組10只孕鼠。海洛因高、中、低劑量組: 分別肌肉注射海洛因130、65 和 32.5 mg·kg-1的海洛因;對(duì)照組: 肌肉注射生理鹽水2 mL·kg-1體重, 各組均從受孕第7天開(kāi)始給藥, 連續(xù)9 d。

1.2.2 胚胎子鼠組織結(jié)構(gòu)發(fā)育觀(guān)察

受孕第20天, 用乙醚吸入麻醉大鼠, 解剖開(kāi)腹腔, 全切取子宮檢查吸收胎、死胎及活胎數(shù), 并對(duì)胎鼠進(jìn)行體表形態(tài)檢查; 每胎取2只活胎仔做透明骨骼標(biāo)本。透明骨骼標(biāo)本制法: 參照《毒理試驗(yàn)方法學(xué)》文獻(xiàn)方法制作, 用透射光源在體視顯微鏡下檢查骨骼。

1.2.3 胚胎仔鼠小腦免疫組織化學(xué)染色

剝?nèi)∨咛プ惺笮∧X組織, 用4%多聚甲醛—1.25戊二醛—磷酸緩沖液(pH7.4)固定24 h, 常規(guī)脫水: 75%乙醇2 h→85%乙醇2 h→95%乙醇1 h→95%乙醇1 h→100%乙醇1 h→100%乙醇1 h→二甲苯1 h→二甲苯1 h。石蠟包埋, 切片, 片厚5 mm。脫蠟: 二甲苯10 min→二甲苯10 min。梯度乙醇復(fù)水: 100%乙醇5 min→95%乙醇5 min→80%乙醇5 min。孵育前用微波處理進(jìn)行抗原修復(fù), 一抗置4℃冰箱孵育48 h, 對(duì)照組用PBS代替一抗, DAB顯色, 蘇木素復(fù)染, 光鏡觀(guān)察, 顯微拍照并進(jìn)行圖像分析。

1.2.4 圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用YA—G5000系列醫(yī)學(xué)細(xì)胞影像分析軟件進(jìn)行圖像拍照及其分析。從每組免疫組織化學(xué)切片中各選5張形態(tài)典型對(duì)應(yīng)切面, 測(cè)量積分吸光度(IOD)、平均吸光度(AOD)。

2 結(jié)果

2.1 海洛因?qū)ε咛グl(fā)育的影響

受孕第20天解剖結(jié)果發(fā)現(xiàn), 海洛因低、中劑量組活胚胎總數(shù)比對(duì)照組分別減少15.87%和29.37%, 海洛因高劑量組孕鼠未見(jiàn)成型的胚胎。見(jiàn)表1, 圖1。

2.2 海洛因?qū)ε咛ケ硇桶l(fā)育的影響

觀(guān)察發(fā)現(xiàn), 海洛因低、中劑量組胚胎出現(xiàn)了多指(右后肢多2指)1例、臍疝1例、卷尾1例、雙側(cè)耳發(fā)育不全1例, 腹裂1例、脊柱側(cè)彎2例、無(wú)耳2例、眼球突出1例、顏面裂1例、下顎裂1例、枕骨裂腦膨出2例; 海洛因高劑量組孕鼠未見(jiàn)成形胚胎。見(jiàn)圖2。

2.3 海洛因?qū)Υ笫笈咛ス趋腊l(fā)育的影響

透明骨骼標(biāo)本觀(guān)察發(fā)現(xiàn), 海洛因低、中劑量胚胎出現(xiàn)枕骨發(fā)育不全, 肋骨、腰椎骨、四肢骨發(fā)育不全, 尾骨與骶骨脫離, 椎骨裂開(kāi), 未骨化; 海洛因高劑量組孕鼠未見(jiàn)成形胚胎。見(jiàn)圖3。

2.4 海洛因?qū)ε咛バ∧X皮層中c—Fos基因表達(dá)水平的影響

光鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn), 海洛因低、中劑量組陽(yáng)性細(xì)胞分布密集, 胞體著色深, 胞質(zhì)和胞核均有表達(dá)。細(xì)胞影像分析, 海洛因低、中劑量組胚胎小腦皮層中表達(dá)水平(IOD)比對(duì)照組分別增加了48.94%和95.74%, 與對(duì)照組相比差異有顯著性(<0.01); 海洛因高劑量組孕鼠未見(jiàn)成形胚胎。見(jiàn)表2。

3 討論

有研究表明, 精神依賴(lài)物(海洛因)不但影響吸食者的身心健康[4], 還嚴(yán)重影響胚胎發(fā)育[5], 影響胚胎出生后幼體的生長(zhǎng)發(fā)育。海洛因成癮不僅導(dǎo)致大腦內(nèi)有關(guān)神經(jīng)核團(tuán)誘導(dǎo)反應(yīng)的急劇增加, 直接損害神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及血腦屏障的通透性改變[6], 而且導(dǎo)致海洛因依賴(lài)者更大區(qū)域大腦損傷和腦功能異常的持續(xù)影響[7]。臨床研究表明: 孕婦吸毒1 h后, 在胎兒體內(nèi)測(cè)出有海洛因代謝產(chǎn)物嗎啡存在。海洛因可直接作用于胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期, 導(dǎo)致胚胎組織器官發(fā)育不全或畸形[8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 給予孕小鼠不同劑量的海洛因, 母鼠及胚胎仔鼠肺組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶 (CAT)活力明顯降低, 丙二醛(MDA)含量顯著升高, 肺組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯的病理性損傷[9]。王園園等[10]研究發(fā)現(xiàn), 孕期使用毒品可影響胎兒大腦的正常發(fā)育, 導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)異常以及行為的改變, 從而導(dǎo)致子代的學(xué)習(xí)記憶和成癮易感性等行為異常[11]。海洛因成癮不僅影響胚胎正常發(fā)育,出現(xiàn)宮內(nèi)死胎、流產(chǎn)、早產(chǎn), 增加新生兒及嬰兒死亡的概率[12], 還使子代表觀(guān)遺傳性發(fā)生改變[13]。屬于快速早期基因是存在于正常神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)的快速反應(yīng)基因, 可在數(shù)分鐘內(nèi)對(duì)外界刺激作出反應(yīng)并進(jìn)行表達(dá), 是聯(lián)系細(xì)胞生化改變與細(xì)胞最終對(duì)刺激發(fā)生特異性反應(yīng)的中介物?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物蛋白被作為神經(jīng)元活動(dòng)變化和傷害性的標(biāo)志。當(dāng)母體受到外界環(huán)境刺激, 如缺氧、缺血[14]時(shí), 胎兒腦組織內(nèi)蛋白的表達(dá)明顯升高[15]。一旦表達(dá), 必將通過(guò)調(diào)控下游靶基因來(lái)影響細(xì)胞內(nèi)蛋白酶、受體、細(xì)胞因子等的表達(dá), 從而引起細(xì)胞功能代謝紊亂, 最終導(dǎo)致組織器官表型的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 給予孕鼠海洛因后, 胚胎表型、骨骼發(fā)育均受到干擾, 小腦組織細(xì)胞表達(dá)顯著增強(qiáng), 從分子生物學(xué)角度證明了海洛因能通過(guò)母體干擾胚胎表型和組織器官的發(fā)育, 誘導(dǎo)胚胎小腦組織細(xì)胞c—Fos基因表達(dá), 損傷腦組織細(xì)胞的發(fā)育, 有關(guān)海洛因影響胚胎發(fā)育的其它分子機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

表1 海洛因?qū)Υ笫笈咛グl(fā)育的影響

注： 1: 對(duì)照組胚胎; 2: 海洛因低劑量組胚胎; 3: 海洛因中劑量組胚胎; 4: 海洛因高劑量組胚胎。

圖1 海洛因?qū)ε咛グl(fā)育的影響

Figure 1 Effect of heroin on embryonic development

注: 1, 2: 海洛因低劑量組, 胚胎耳、顱骨、后肢趾發(fā)育不全; 3, 4, 5: 海洛因中劑量組, 胚胎耳、顱骨、前后肢及趾骨發(fā)育不全, 顱腦膨出。

Figure 2 Effects of heroin on embryonic organ development

注: 1: 對(duì)照組胚胎骨骼; 2, 3: 海洛因低、中劑量組胚胎骨骼, 胚胎顱骨、肋骨、前后肢及趾發(fā)育不全。

Figure 3 Effect of heroin on embryonic skeletal development

表2 海洛因?qū)ε咛バ∧X皮層中c-Fos基因表達(dá)水平的影響(±s)

注： 與對(duì)照組比:**<0.01。

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Effects of spiritual dependence (heroin) on morphological structure development andexpression in cerebellar cortex of embryonic rats

XIE Mingren, GUAN Haiyan, LU Jianzhen, YU Farong*

School of Public Security Technology, Gansu University of Political Science and Law, Key Laboratory of Evidence of Science and Technology Research and Application, Lanzhou 730070, China

To investigate the effects of spiritual dependence(heroin) on morphological structure development andexpression in cerebellar cortex of embryonic rats, the pregnant Wistar rats were randomly divided into control group and heroin drug group(divided into low, medium and high dose heroin groups).On the 7th day after conception, Wistar rats were treated with32.5, 65 and 130 mg·kg-1heroin for 9 d. The effects of spiritual dependence(heroin) on the morphological and structural development of embryonic rats were observed. Theexpression level in cerebellar cortex of embryonic rats was determined by immunohistochemical staining. The results showed that low, medium dose heroin groups, the total number of live embryos decreased by 15.87 % and 29.37 % respectively, compared with the control group. Multiple fingers, umbilical hernia, two ears, ribs, lumbar vertebrae, and forelimb metacarpal bone dysplasia occurred in low and medium dose groups of heroin; in high dose group of heroin no embryo was formed in pregnant rats. Cell imaging and immunohistochemical tests showed thatexpression level(IOD) was increased by 48.94 % and 95.74 %, respectively, in the cerebellar cortex of low and middle dose groups of heroin, compared with the control group(<0.01). The results showed that spiritual dependence(heroin) inhibits the morphological development and cerebellarexpression level in embryonic rats, and the inhibition increases with the increase of the dose to heroin.

heroin; embryonic development;

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.06.020

Q954.4

A

1008-8873(2019)06-136-04

2019-02-19;

2019-08-25

甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(17JR5RA158);甘肅省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(編號(hào): 2016C—09);蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015—3—80);蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(2016—RC—85); 甘肅政法學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目(GZF2014XZDLW17)。

謝明仁(1977—), 男, 甘肅民勤人, 碩士, 副教授, 主要從事證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與教學(xué), E-mail: Xmr6700@gsli.edu.cn.

俞發(fā)榮, 男, 博士, 研究員, 主要從事法醫(yī)生物學(xué)、藥理學(xué)和毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究, E-mail: tim9898@163.com

謝明仁, 管海彥, 盧建珍, 等. 精神依賴(lài)物(海洛因)對(duì)胚胎大鼠形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育和小腦基因表達(dá)的影響[J]. 生態(tài)科學(xué), 2019, 38(6): 136-139.

XIE Mingren, GUAN Haiyan, LU Jianzhen, et al. Effects of spiritual dependence (heroin) on morphological structure development andexpression in cerebellar cortex of embryonic rats[J]. Ecological Science, 2019, 38(6): 136-139.