徐成翠，張瑤瑤，鄭積榮，張敬澤，盧鋼*

(1.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310058； 2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310024)

番茄(LycopersiconesculentumMill.)為茄科一年生草本植物[1]，原產(chǎn)于南美洲，在我國廣泛栽培，是中國最重要的蔬菜之一。番茄灰葉斑病是番茄的一種重要病害，病原為茄葡柄霉(Stemphyliumspp.)，屬半知菌亞門葡柄霉屬真菌，該病菌主要危害葉片，環(huán)境條件適宜時，還危害莖稈和果實，為害嚴(yán)重時，導(dǎo)致全部葉片變黃，被侵染的葉片逐漸變褐枯萎并從植株上脫落。灰葉斑病可導(dǎo)致番茄減產(chǎn)20%～80%，同時造成番茄果實質(zhì)量下降[2]。另外近年來受到番茄黃化曲葉病毒病的影響，很多地區(qū)都種植了抗病毒病品種，田間種植表明這些品種對真菌性病害尤其是灰葉斑病的抵抗能力較低，所以灰葉斑病已經(jīng)成為我國冬春季番茄的主要病害之一，給番茄生產(chǎn)帶來了不可低估的影響。

在適宜條件下，番茄灰葉斑病傳播極快，從發(fā)病到全株葉片感染只需2～3 d，利用化學(xué)防治難度較大，所以培育抗病品種是防治灰葉斑病既經(jīng)濟(jì)、有效又安全的措施。在番茄育種中對病原菌抗性鑒定和番茄抗源的篩選尤為重要，而鑒定方法的選用又是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本文從分離番茄灰葉斑病病原菌入手，建立早期抗性快速鑒定方法，并利用該方法對81份國內(nèi)外引進(jìn)的抗性種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定篩選，為番茄抗灰葉斑病品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄品種Micro-Tom、TH1353等用于比較不同抗病性鑒定技術(shù)，從國內(nèi)外廣泛引進(jìn)的78份番茄育種材料及3份雜交組合用于抗性資源鑒定。以上材料均由浙江大學(xué)蔬菜研究所番茄課題組繁殖保存。

番茄種子先用紗布包好，于55 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)浸種15 min，然后在常溫下浸泡4 h，取出置于28 ℃恒溫箱內(nèi)保濕催芽3 d直至種子露白，最后播于穴盤中(基質(zhì)配比為草炭土∶蛭石∶珍珠巖為3∶2∶1)，光、暗培養(yǎng)周期為16 h 28 ℃/8 h 23 ℃，光照強(qiáng)度為300 μmol·m-2·s-1。

1.2 病原菌分離和鑒定

1.2.1 病原菌的分離

從浙江省杭州蔬菜研究所大棚發(fā)病植株上采集具有典型癥狀的病葉，用于病原菌的分離。

組織分離法分離病原菌。剪取1 cm2見方的病健交界處有明顯病征的病葉，在10%NaClO中消毒3 min，無菌水漂洗3次，于無菌濾紙上晾干，擺放于PDA培養(yǎng)基上，置(25±2)℃黑暗中培養(yǎng)出菌落，取1 cm2見方菌塊置于新PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)[3]。

直接分離病原菌。用鑷子刮取少量表面物于無菌水中混勻，均勻涂抹在有網(wǎng)格狀標(biāo)記的瓊脂板培養(yǎng)基上，在顯微鏡下挑取茄匐柄霉單胞存在的培養(yǎng)基方格，置于PDA培養(yǎng)基上，在(25±2)℃，12 h/12 h光暗下培養(yǎng)，再進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 病原菌鑒定

病原菌孢子的鑒定。將純化菌種轉(zhuǎn)到PDA培養(yǎng)基上，在黑光燈照射和黑暗交替條件下培養(yǎng)產(chǎn)生孢子，在400倍顯微鏡下觀察。

接種鑒定。將分離的病原菌孢子懸浮液的孢子濃度稀釋至100倍顯微鏡視野上40個孢子(約8×105孢子·mL-1)，采用滴接法接種至番茄Micro-Tom葉片上，統(tǒng)計接種后葉片發(fā)病情況。采集發(fā)病的葉片進(jìn)行病原菌分離試驗，與病原菌的菌落進(jìn)行對比。

1.3 番茄抗性鑒定方法比較

1.3.1 離體接種和活體接種

離體接種。不同番茄品種在溫室育苗，待長至4～5葉期剪取頂部向下第2～3葉片，流水沖洗后，無菌水沖洗3次，平鋪于預(yù)先鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿(9 cm×9 cm)中，采用涂抹法進(jìn)行接種，置于25 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，接種后第6天調(diào)查。

活體接種。對4～5葉期植株頂部向下第2～3葉片涂抹接種，控制相對濕度100%，溫度(25±2)℃，培養(yǎng)2 d后恢復(fù)正常培養(yǎng)，接種后第10天調(diào)查，分別計算病情指數(shù)。

1.3.2 噴霧和涂抹接種技術(shù)

不同番茄品系在溫室育苗，待長至4～5葉期摘取植株頂部向下第2～3葉片進(jìn)行離體抗病性鑒定。接種所用番茄灰葉斑病孢子懸浮液濃度為100倍顯微鏡視野約15個孢子(約3×105孢子·mL-1)。

噴霧接種。用噴壺將番茄灰葉斑病孢子懸浮液均勻噴霧于葉片至有水滴滴落，每片葉約接種0.2 mL。每個品系接種4株，重復(fù)3次。

涂抹接種。用毛筆蘸取番茄灰葉斑病孢子懸浮液對選取的葉片涂抹，每片葉約接種0.2 mL。每處理4株8片葉，重復(fù)3次。接種后第6天根據(jù)病情分級標(biāo)準(zhǔn)計算病情指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計分析方法

1.4.1 病情分級

根據(jù)灰葉斑病接種后病葉發(fā)病程度，參照Cho等[4]致病力分級方法進(jìn)行分級調(diào)查。番茄灰葉斑病病情分為5級：1級，葉片上無癥狀；2級，有黑色枯死點，占葉面積10%以下；3級，病斑面積占葉片面積的11%～20%；4級，病斑占葉面積21%～50%；5級，病斑占葉面積50%以上。

1.4.2 病情指數(shù)及抗病評價體系

病情指數(shù)=Σ[(該病級值×病級葉片數(shù))/(最高病級數(shù)×調(diào)查總?cè)~片數(shù))]×100%。

抗性評價標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5-6]方法，分為免疫(I，不表現(xiàn)癥狀，病情指數(shù)為0)、高抗(HR，0 <病情指數(shù)≤1.5)、中抗(MR，1.5<病情指數(shù)≤5)、中感(MS，5<病情指數(shù)≤25)、感病(S，25<病情指數(shù)≤100)，并將I、HR及MR歸為抗病，將MS和S歸為感病。

1.5 番茄抗源的篩選

從國內(nèi)外引進(jìn)78份番茄育種材料及3份雜交組合，共81份種質(zhì)資源用于抗性鑒定。當(dāng)番茄長至6～7葉期時，利用涂抹法進(jìn)行離體接種鑒定，接種部位為頂端向下第2～3片真葉展開，每處理4株8片葉，重復(fù)3次。接種后保濕24 h，接種6 d后調(diào)查病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的鑒定

通過顯微鏡觀察到，菌絲體初為白色，后漸呈暗褐色，以及清晰的病原菌孢子圖像，分生孢子多單生，倒短棒或橢圓形，頂端鈍圓、褐色、光滑，磚格狀分隔，一般有3個橫隔，1～3個縱隔膜，分生孢子大小為30～55 μm×13～25 μm。單胞茄匐柄霉菌培養(yǎng)時會有色素顯現(xiàn)，為黃褐色至紅褐色。接種到番茄Micro-Tom葉片上，結(jié)果表現(xiàn)為灰葉斑病癥狀(圖1)，證實所分離的病原菌為灰葉斑病致病菌。

2.2 抗病性鑒定方法比較

2.2.1 離體葉片與苗期活體接種法比較

由表1可知，比較苗期活體接種和離體葉片接種體系的病情指數(shù)大小發(fā)現(xiàn)，活體接種結(jié)果和離體接種結(jié)果基本一致。TY-1活體接種表現(xiàn)為高抗，離體接種表現(xiàn)為中抗；TY-25、T101F-201兩種接種方式下均表現(xiàn)為中抗；TY-11均表現(xiàn)為中感；但品系T101F-204在活體接種時表現(xiàn)為中感，在離體葉片接種時表現(xiàn)為感病。從4個品系的接種方法比較結(jié)果來看，離體接種后的病情指數(shù)比苗期活體接種平均增高1.3百分點，而在T101F-204品系中，病情指數(shù)增高12.8百分點，離體接種出現(xiàn)癥狀比活體接種更加明顯。2種接種方法的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.907 5，說明2種接種鑒定方法均可用于番茄灰葉斑病抗病性鑒定。

圖1 番茄灰葉斑病病原孢子分離與鑒定

表1 番茄苗期不同接種方法病情指數(shù)比較

2.2.2 涂抹法與噴霧法比較

由表2可知，2種接種方法均表現(xiàn)出噴霧法病情指數(shù)低于涂抹法，且涂抹法接種的品種間的病情指數(shù)差異更大，意味著對不同抗病性品種的區(qū)分度更高，且涂抹法不同重復(fù)間的標(biāo)準(zhǔn)誤更小，說明其更有利于減少操作誤差。

表2 不同接種方法病情指數(shù)比較

2.3 抗源篩選

試驗表明，不同番茄品系間灰葉斑病的抗性差異很大。有的品系所有葉片均發(fā)病且十分嚴(yán)重，幾乎整個葉片發(fā)黃褐化。但采用同樣方法接種病原菌，且在相同培養(yǎng)條件下，部分材料的葉片幾乎不發(fā)病，也觀察不到病原菌，不同品系之間葉片發(fā)病的病情指數(shù)差異巨大。表3顯示，在接種的81個番茄自交系或雜交組合中，LA3528、LA3911、LA2823、CLN2264G、LA1802、LS-1306F、LS-1313F等7份材料表現(xiàn)出較強(qiáng)的番茄灰葉斑病抗病性，尤其是LA3528和LA3911為野生番茄材料，對番茄灰葉斑病高抗。LA3528、LA3911、LA2823、LA4285、LA1802均來自于美國種質(zhì)資源庫，CLN2264G來自于亞蔬中心，LS-1313F和Ty-1101為項目組保存的兩個自交系。同時發(fā)現(xiàn)，TY-1138、TY-1147、TY-1116、TY-1142、TY-1108、TY-1123、TY-1144、N9021、T010-51是易感材料，病情指數(shù)在44.7%～75.3%，而這些材料大多含有黃化曲葉病毒病抗性基因。

3 小結(jié)與討論

番茄抗病材料的鑒定與篩選是抗病育種過程中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。簡便易行的接種體系的建立對番茄抗病材料的鑒定與篩選極為重要。從活體接種和離體的接種結(jié)果來看，兩種接種方法的結(jié)果基本一致，說明兩種接種鑒定方法均可用于番茄抗灰葉斑病資源篩選、品種(系)抗性鑒定，對于珍貴材料或者在番茄材料比較少的情況下，可以采用離體葉片接種的方法對材料進(jìn)行抗性鑒定，簡化育種的工作及流程。另外接種結(jié)果顯示，離體接種出現(xiàn)的癥狀比活體接種更明顯，因而對于篩選到的抗病品種可以采用離體接種的方法進(jìn)一步高效地篩選出高抗品種。葉片離體接種時采用涂抹法對于驗證品種間抗病性的區(qū)分度更高，且涂抹法接種均勻，相對于噴霧法更容易控制試驗變量，減少由操作引起的試驗誤差。

接種試驗共篩選出對灰葉斑病免疫的材料1份，高抗材料6份，中抗材料13份。感病品種的感病系數(shù)超過40%的極感病材料有13份，不同材料對番茄灰葉斑病的抗性差異明顯。同時發(fā)現(xiàn)，雜交組合TY1101♀×LA2823♂與母本的抗病性表現(xiàn)一致，表現(xiàn)為中等抗性，可能父本的高抗基因為隱性或者在細(xì)胞質(zhì)中遺傳。另外發(fā)現(xiàn)，TY-1138、TY-1147、TY-1116等是易感材料，病情指數(shù)在44.7%～75.3%，這些材料大多含有黃化曲葉病毒病抗性基因。據(jù)報道，山東壽光地區(qū)大面積推廣抗黃化曲葉病毒(TYLCV)病番茄品種后番茄灰葉斑病呈現(xiàn)出暴發(fā)流行趨勢[7]，劉國華[8]曾報道抗TYLCV的番茄品種灰葉斑病發(fā)病較重。目前在生產(chǎn)上推廣的抗TYLCV番茄品種，如迪芬尼、齊達(dá)利、迪利奧、金棚8號、金棚10號等均表現(xiàn)為對灰葉斑的感病性，且感病后發(fā)病速度快，影響番茄的品質(zhì)和產(chǎn)量[7]。本研究的抗性鑒定進(jìn)一步證實了抗TYCLV品種大多容易發(fā)生灰葉斑病，對番茄的生產(chǎn)造成較大危害，因而從國外引進(jìn)推廣抗TYCLV番茄品種時應(yīng)注意防治灰葉斑病，注重引進(jìn)品種的本土適應(yīng)性，同時應(yīng)加快選育兼抗品種[9-10]。

表3 番茄苗期活體接種灰葉斑病病原菌不同品種病情指數(shù)