付雙彬，池夢(mèng)薇，楊燕萍，姚麗娟，周莊*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005； 2.福建農(nóng)林大學(xué) 園林學(xué)院，福建 福州 350002)

苦苣苔科植物種類(lèi)繁多，全世界約有140屬，2 000余種，我國(guó)有58屬463種?？嘬奶浦参镏性S多具有極高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值[1-2]，其中臺(tái)閩苣苔(Titanotrichumoldhamii(Hemsl.) Soler.)隸屬于臺(tái)閩苣苔屬，為苦苣苔科單屬單種植物，是我國(guó)的特有種，分布范圍狹窄，特產(chǎn)于浙江、福建和臺(tái)灣，屬瀕危稀有種，由于其在苦苣苔科系統(tǒng)中的特殊位置，其研究和開(kāi)發(fā)具有重要意義[2-3]。

對(duì)于瀕危的重要植物，基于組織培養(yǎng)的繁殖和離體保存是現(xiàn)今較為有效的方法[4]，通過(guò)組織培養(yǎng)的方法，可以使用少量的植物材料，在短期內(nèi)繁殖大量的優(yōu)質(zhì)幼苗，從而用于研究和保護(hù)。現(xiàn)今已有許多苦苣苔屬植物組織培養(yǎng)的報(bào)道[5-6]，而對(duì)于臺(tái)閩苣苔的組培研究不多，存在一些激素的作用以及愈傷組織、不定芽誘導(dǎo)分化的效率不高等現(xiàn)象[2-3]，因此，本文以臺(tái)閩苣苔無(wú)菌苗的葉片為材料，研究了生長(zhǎng)素2,4-D、NAA，細(xì)胞分裂素6-BA、TDZ、KT不同濃度以及組合對(duì)于臺(tái)閩苣苔無(wú)菌苗葉片分化再生的影響，以期為臺(tái)閩苣苔的組培繁殖提供更詳盡的補(bǔ)充，為臺(tái)閩苣苔的保護(hù)和開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為臺(tái)閩苣苔無(wú)菌苗，接種時(shí)將整個(gè)葉片剪下，近軸面朝上直接接在培養(yǎng)基上。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

以MS[6]為基本培養(yǎng)基，添加白砂糖30 g·L-1，瓊脂7.5 g·L-1，調(diào)pH至5.8，于121 ℃滅菌30 min。外植體接種后在溫度(25±2)℃、光照強(qiáng)度2 000 lx、光照時(shí)間16 h·d-1的條件下培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 NAA和6-BA不同濃度及組合對(duì)于臺(tái)閩苣苔葉片分化的影響

添加NAA和6-BA濃度分別為0、0.2、0.4、0.8、1.2 mg·L-1，對(duì)兩種激素進(jìn)行完全隨機(jī)的組合試驗(yàn)，每瓶接種5個(gè)葉片，重復(fù)5次。在第30天統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率、愈傷誘導(dǎo)率和死亡率，在第120天統(tǒng)計(jì)記錄最終生長(zhǎng)情況。

1.3.2 NAA和TDZ不同濃度及組合對(duì)于臺(tái)閩苣苔葉片分化的影響

添加TDZ濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg·L-1，NAA 0、0.1 mg·L-1，對(duì)兩種激素進(jìn)行完全隨機(jī)的組合試驗(yàn)，每瓶接種5個(gè)葉片，重復(fù)5次。在第30天統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率、愈傷誘導(dǎo)率和死亡率，在第120天統(tǒng)計(jì)記錄最終生長(zhǎng)情況。

1.3.3 NAA和KT不同濃度及組合對(duì)于臺(tái)閩苣苔葉片分化的影響

添加KT濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg·L-1，NAA 0、0.1 mg·L-1，對(duì)兩種激素進(jìn)行完全隨機(jī)的組合試驗(yàn)，每瓶接種5個(gè)葉片，重復(fù)5次。在第30天統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率、愈傷誘導(dǎo)率和死亡率，在第120天統(tǒng)計(jì)記錄最終生長(zhǎng)情況。

1.3.4 2,4-D和6-BA不同濃度及組合對(duì)于臺(tái)閩苣苔葉片分化的影響

添加2,4-D濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg·L-1，6-BA 0、0.1 mg·L-1，對(duì)兩種激素進(jìn)行完全隨機(jī)的組合試驗(yàn)，每瓶接種5個(gè)葉片，重復(fù)5次。在第30天統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率、愈傷誘導(dǎo)率和死亡率，在第120天統(tǒng)計(jì)記錄最終生長(zhǎng)情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

不定芽和愈傷數(shù)(量)從高到低依次記為極多(大)、多(大)、少(小)；葉根完整，株高5 cm以上記為完整植株。

不定芽誘導(dǎo)率/%=誘導(dǎo)出不定芽的葉片數(shù)/葉片接種數(shù)×100；愈傷誘導(dǎo)率/%=誘導(dǎo)出愈傷的葉片數(shù)/葉片接種數(shù)×100；死亡率/%=死亡葉片數(shù)/葉片接種數(shù)×100。圖表用Microsoft Excel 2016繪制，數(shù)據(jù)用平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差分析和多重比較(LSD)需將數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換后進(jìn)行，分析軟件采用SPSS 22.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAA和6-BA不同濃度及組合對(duì)于臺(tái)閩苣苔葉片分化的影響

由表1可以看出，在所有處理中，除6-BA為1.2 mg·L-1，NAA為0.2～1.2 mg·L-1時(shí)，其它均能100%誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，這些不定芽未經(jīng)過(guò)愈傷組織而直接產(chǎn)生，并且數(shù)量極多，后期通過(guò)增殖、生根等可再生為植株[2-3]。單獨(dú)來(lái)看，在不添加任何激素的培養(yǎng)基中，葉片能直接分化再生植株，并且會(huì)有少量根產(chǎn)生，但植株多而不壯，根少而不強(qiáng)，直接移栽不易成活，但可通過(guò)生根培養(yǎng)基進(jìn)行再生根壯苗提高移栽存活率(圖1中A、B)。在只添加NAA的培養(yǎng)基先期產(chǎn)生一定量的不定根，后期全部為愈傷組織，其中摻雜少許不定芽(圖1中C、D)，并且這些愈傷在新培養(yǎng)基中能夠增殖，轉(zhuǎn)入不含激素的培養(yǎng)基中可分化出不定芽(圖1中E)。在添加6-BA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出大量不定芽(圖1中F)，其中，在只添加6-BA的培養(yǎng)基中，一些不定芽在后期可直接再生成植株，這些植株同樣多而不壯；而在同時(shí)添加NAA和6-BA的培養(yǎng)基中，后期又會(huì)產(chǎn)生少量愈傷組織，但不會(huì)有植株產(chǎn)生(圖1中G)。

表1 NAA和6-BA不同濃度及組合對(duì)于臺(tái)閩苣苔葉片分化的影響

2.2 NAA和TDZ不同濃度及組合對(duì)于臺(tái)閩苣苔葉片分化的影響

如表2所示，所有的組合中都有不定芽產(chǎn)生，其中以TDZ 0.5、3.0 mg·L-1中不定芽誘導(dǎo)率最高，與1.0～2.0 mg·L-1TDZ，2.0～3.0 mg·L-1TDZ+0.1 mg·L-1NAA的處理差異不顯著，并且這些產(chǎn)生的不定芽數(shù)量極多；在單獨(dú)添加TDZ的培養(yǎng)基中，所有處理都能誘導(dǎo)出愈傷組織，其中以TDZ 3.0 mg·L-1誘導(dǎo)率最高，這些愈傷組織量相對(duì)NAA誘導(dǎo)量較少，顏色呈深綠色，表面呈顆粒狀，其出現(xiàn)往往在產(chǎn)生不定芽之后(圖1中H)。

A—在未添加激素的培養(yǎng)基中獲得的再生植株；B—再生植株生根；C—在只含NAA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的不定根；D—在只含NAA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的愈傷；E—愈傷誘導(dǎo)不定芽；F—在NAA和6-BA組合下誘導(dǎo)的大量不定芽；G—NAA和6-BA組合誘導(dǎo)，后期不定芽和愈傷混合；H—TDZ誘導(dǎo)的愈傷；I—NAA和KT組合下誘導(dǎo)的不定根和不定芽；J—添加2,4-D誘導(dǎo)的愈傷。圖1 臺(tái)閩苦苣苔的分化再生

表2 NAA和TDZ不同濃度及組合對(duì)于臺(tái)閩苣苔葉片分化的影響

注：同列無(wú)相同小寫(xiě)字母表示組間在5%水平上差異顯著。表3同。

此外，在TDZ 0.1～0.5 mg·L-1時(shí)，同時(shí)添加NAA的培養(yǎng)基中會(huì)產(chǎn)生少量完整植株。

2.3 NAA和KT不同濃度及組合對(duì)于臺(tái)閩苣苔葉片分化的影響

如表3所示，KT的作用與6-BA相同，主要誘導(dǎo)不定芽，但效果卻不如6-BA，并且無(wú)論低濃度或高濃度都有一定的死亡；其中以KT 1.0 mg·L-1、KT 1.0～2.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1不定芽誘導(dǎo)率最高，與KT 2.0 mg·L-1，處理差異不顯著，而添加有NAA的培養(yǎng)基中，與單獨(dú)添加NAA相似，先期誘導(dǎo)出一定量的不定根，呈不定芽和不定根混合的狀態(tài)，但無(wú)愈傷組織產(chǎn)生(圖1中I)。

2.4 2,4-D和6-BA不同濃度組合對(duì)于臺(tái)閩苣苔葉片分化的影響

在添加2,4-D的培養(yǎng)基中，在2,4-D為0.1和0.5 mg·L-1時(shí)，全部產(chǎn)生愈傷，并有少量不定芽產(chǎn)生，其他濃度均大部分死亡，這些愈傷組織與NAA和TDZ誘導(dǎo)的愈傷組織均不同，初始呈黃褐色(圖1、表4)，這些愈傷組織在新培養(yǎng)基中能夠增殖，轉(zhuǎn)入不含激素的培養(yǎng)基中也可分化出不定芽[3]。

表3 NAA和KT不同濃度及組合對(duì)于臺(tái)閩苣苔葉片分化的影響

表4 2,4-D和6-BA不同濃度及組合對(duì)于臺(tái)閩苣苔葉片分化的影響

3 小結(jié)與討論

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是組培快繁的重要影響因子，不同種類(lèi)、不同濃度的激素對(duì)于外植體的分化再生等都有重要的影響。在許多苦苣苔屬的植物組培過(guò)程中，不定芽的誘導(dǎo)一般采用較低濃度的細(xì)胞分裂素，較高的濃度會(huì)抑制不定芽的伸長(zhǎng)，并會(huì)對(duì)后續(xù)的生根造成影響[3,7]。如湯正輝等[2]、Takagi等[3]在研究臺(tái)閩苣苔時(shí)，誘導(dǎo)不定芽分化培養(yǎng)基中6-BA都為0.1 mg·L-1，此外其他屬內(nèi)植物如半蒴苦苣苔[8]、桂林小花苣苔[9]等也采用此濃度。在本文中單獨(dú)添加6-BA 0.2～0.8 mg·L-1時(shí)誘導(dǎo)出大量不定芽，而這些不定芽在后期可直接再生成植株，而附加一定濃度NAA同樣能誘導(dǎo)大量的不定芽，但不能自主再生成植株。當(dāng)6-BA提高到1.2 mg·L-1時(shí)，葉片開(kāi)始出現(xiàn)死亡，此時(shí)濃度是不適宜的。

同為細(xì)胞分裂素，KT的作用效果較6-BA要強(qiáng)[10]，但對(duì)于臺(tái)閩苣苔葉片外植體的誘導(dǎo)效果并不如6-BA，在較低濃度下才有比較好的效果，較高時(shí)外植體枯黃死亡率較高。同樣的，在非洲紫羅蘭的組培中，6-BA與NAA的搭配優(yōu)于KT與NAA的搭配[11]，此外其他研究者對(duì)比研究了在NAA濃度固定的前提下，與6-BA、KT、ZT和2,4-D 4種不同激素配合的誘導(dǎo)效果，結(jié)果均表明6-BA的誘導(dǎo)率最高[12]。

NAA、2,4-D在許多植物的組培中對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)起重要作用[10]，如苦苣苔屬植物大巖桐愈傷組織的形成最佳激素組合為2,4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1[13]，而在臺(tái)閩苣苔中添加0.1 mg·L-12,4-D即可誘導(dǎo)出大量愈傷組織，但2,4-D的量要嚴(yán)格控制，過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致外植體死亡，并且對(duì)不定根的誘導(dǎo)是不利的[14]。NAA有誘導(dǎo)不定根的效力，這在單獨(dú)添加NAA和KT、NAA的組合中體現(xiàn)較明顯，在單獨(dú)添加NAA 0.2～1.2 mg·L-1時(shí)，先期產(chǎn)生一定量不定根，后期葉片外植體全部誘導(dǎo)出愈傷組織，而且質(zhì)量也較2,4-D的高。

TDZ是一種效果很強(qiáng)的細(xì)胞分裂素，被認(rèn)為具有生長(zhǎng)素和分裂素雙重作用[15]，在許多植物的愈傷誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，在褐紋報(bào)春苣苔的組培研究中，添加2.0 mg·L-1TDZ+0.1 mg·L-1NAA適于愈傷誘導(dǎo)[16]；文弢等[17]在大苞短毛唇柱苣苔的不定芽誘導(dǎo)時(shí)，發(fā)現(xiàn)TDZ起主要作用，當(dāng)濃度為0.5 mg·L-1有利于誘導(dǎo)率和不定芽數(shù)量的提高。在此文中TDZ單獨(dú)添加主要誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，同時(shí)附帶大量不定芽，往往愈傷組織出現(xiàn)在后；而在TDZ低濃度時(shí)添加NAA，會(huì)減少愈傷誘導(dǎo)效果，而向不定芽和再生植株的方向轉(zhuǎn)變。

臺(tái)閩苣苔葉片外植體不經(jīng)切割，在不含激素或含0.2～0.8 mg·L-16-BA的MS上能直接再生成植株，雖然這些植株移栽成活率較低，但植株的完整性表明這些材料在后續(xù)研究中的潛在價(jià)值以及繼續(xù)研究的價(jià)值；此外，TDZ、NAA、2,4-D對(duì)于愈傷誘導(dǎo)的高質(zhì)量、高效率為臺(tái)閩苣苔后續(xù)的保護(hù)和開(kāi)發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。