朱春玉， 趙 瑩， 易文富， 劉宏生， 鄭方亮

(遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036)

禽流感疫情被稱(chēng)為“雞瘟”，首次發(fā)現(xiàn)于1878年，該疫情導(dǎo)致意大利家雞大量死亡。此后，“雞瘟”在全世界的影響范圍逐漸擴(kuò)大，直到1955年，Schafer發(fā)現(xiàn)并證實(shí)“雞瘟”的罪魁禍?zhǔn)资茿型流感病毒，因其感染禽類(lèi)而被稱(chēng)為禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)。AIV感染能夠引起禽類(lèi)從呼吸系統(tǒng)到嚴(yán)重全身敗血癥等多種癥狀，通常會(huì)引起家禽大批量死亡，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)毀滅性打擊，自1997年首次報(bào)道禽流感感染人致死病例以來(lái)，全球爆發(fā)了多次禽流感感染人致死的疫情，給人類(lèi)健康造成嚴(yán)重威脅，因此該病毒是一種人畜共患病毒[1-2]。AIV屬于正黏病毒科，基因組由8條RNA構(gòu)成，根據(jù)病毒表面神經(jīng)氨酸酶和血凝素的不同分為眾多亞型[3]。目前已經(jīng)確認(rèn)有7種病毒亞型能夠感染人類(lèi)，多為H5和H7亞型的高致病性禽流感病毒。禽流感病毒通過(guò)表面血凝素(HA)與宿主細(xì)胞表面受體的特異性識(shí)別結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞，在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制后最終以出芽的方式釋放。在復(fù)制過(guò)程中，由其自身編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白1(non-structural protein 1，NS1)通過(guò)與宿主細(xì)胞多種蛋白的相互作用從而調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制。其中人核仁磷酸化蛋白(nucleolar and coiledbody phosphoprotein 1，NOLC1)，又名hNopp140或Nopp140，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種NS1的相互作用蛋白，該蛋白參與核仁組裝、細(xì)胞發(fā)育和腫瘤發(fā)生等過(guò)程，同時(shí)在禽流感病毒感染過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用[4]。

1 NOLC1蛋白的結(jié)構(gòu)

NOLC1蛋白是一種核定位信號(hào)結(jié)合蛋白，大小為140 kDa，最早在大鼠肝細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)并鑒定。NOLC1蛋白能在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中穿梭[5]，在細(xì)胞間期NOLC1蛋白以顆粒狀形態(tài)存在于核仁之中，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂時(shí)期時(shí)，NOLC1蛋白的顆粒狀形態(tài)便不復(fù)存在，被均勻分配到兩個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，隨后與RNA聚合酶Ⅰ發(fā)生相互作用表達(dá)rRNA基因，參與核仁發(fā)生的過(guò)程[6]。NOLC1蛋白結(jié)構(gòu)特殊，它不具有RNA結(jié)合域和富含谷氨酸/精氨酸的鏈段，而是包含保守的N-末端、C-末端以及一個(gè)由多個(gè)重復(fù)的酸性和堿性氨基酸構(gòu)成的中心結(jié)構(gòu)域。中心結(jié)構(gòu)域由帶正電和帶負(fù)電的氨基酸交替組成，最可能的理由是為蛋白之間發(fā)生相互作用提供作用位點(diǎn)[7]。NOLC1蛋白具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，是細(xì)胞內(nèi)磷酸化程度最高的蛋白之一[6]。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可以使NOLC1蛋白磷酸化的蛋白激酶有酪蛋白激酶2(CK2)、細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶2(cdc2激酶)和蛋白激酶A(PKA)[8]。NOLC1蛋白由于含有82個(gè)酪蛋白激酶CK2靶序列，因此主要依賴(lài)于CK2的磷酸化發(fā)揮作用[9]。同時(shí)，NOLC1蛋白還可與CK2結(jié)合，作為CK2的高度磷酸化蛋白抑制劑抑制該酶的催化活性[10]。

2 NOLC1蛋白的功能

現(xiàn)有研究證明，NOLC1蛋白能夠與多種核仁蛋白及核仁生物合成相關(guān)蛋白相互作用。NOLC1蛋白含有一段名為Nopp140.24的核定位信號(hào)序列，能夠保證其在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中穿梭[6]。NOLC1蛋白能夠同RNA聚合酶Ⅰ相互作用調(diào)節(jié)rRNA的合成，參與核仁裂解、組裝和維持完整的過(guò)程[11]。NOLC1蛋白能夠與核仁小核糖蛋白體顆粒(snoRNP)發(fā)生相互作用，幫助snoRNP在Cajal小體(Cajal body,CB)內(nèi)組裝成熟后穿過(guò)不同的核間隔并轉(zhuǎn)運(yùn)到核仁中發(fā)揮作用[12]。He等[13]研究發(fā)現(xiàn)果蠅的Nopp140基因缺失會(huì)誘導(dǎo)亞細(xì)胞核糖體發(fā)生病變。Lee等[14]證實(shí)了新桿狀線(xiàn)蟲(chóng)的一種核仁蛋白DAO-5基因是Nopp140基因家族的成員之一，DAO-5基因?qū)υ缙谂咛ゼ?xì)胞的細(xì)胞核的生物合成具有重要作用，DAO-5基因會(huì)導(dǎo)致cep-1基因發(fā)生反式激活進(jìn)而降低rDNA的轉(zhuǎn)錄速率，誘導(dǎo)核糖體發(fā)生病變，生殖細(xì)胞系發(fā)生凋亡。

NOLC1蛋白還參與炎癥發(fā)生、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生等相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控。Hwang 等[15]研究發(fā)現(xiàn)干擾NOLC1可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制為NOLC1蛋白通過(guò)與TP53區(qū)的啟動(dòng)子結(jié)合并與TP53的協(xié)同作用來(lái)調(diào)節(jié)MDM2表達(dá)，從而參與鼻咽癌的調(diào)節(jié)，這表明NOLC1蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起致癌基因的作用。NOLC1蛋白在肝癌細(xì)胞的生存發(fā)展中同樣具有十分關(guān)鍵的作用。與非癌細(xì)胞相比，NOLC1在肝腫瘤組織中被沉默或下調(diào)[4]。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和CREB能夠通過(guò)與NOLC1的最小啟動(dòng)子結(jié)合對(duì)NOLC1蛋白的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，通過(guò)對(duì)NOLC1啟動(dòng)子的激活作用上調(diào)NOLC1的表達(dá)[11]。研究發(fā)現(xiàn)抑制NF-κB活化會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的肝細(xì)胞凋亡，從而無(wú)法發(fā)展成肝細(xì)胞癌[16]；CREB也被證實(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)、血管生成和細(xì)胞凋亡的過(guò)程在肝細(xì)胞癌進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[17]，以上可能是NOLC1調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞發(fā)生的作用機(jī)制。NOLC1蛋白在肺癌腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)中也發(fā)揮作用，但具體作用機(jī)制仍未明了，肺癌腫瘤的抑制可能與受到p53上調(diào)導(dǎo)致的NOLC1下調(diào)有關(guān)[18-19]。

研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)和敲降NOLC1都會(huì)導(dǎo)致肺癌細(xì)胞凋亡增加，但過(guò)表達(dá)NOLC1會(huì)更加促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。過(guò)表達(dá)NOLC1對(duì)肺癌細(xì)胞的促凋亡率明顯高于正常細(xì)胞，其可能通過(guò)線(xiàn)粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑、TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑以及cyclin Y介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑共同誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)NOLC1使肺癌細(xì)胞膜電位下降，增加了肺癌細(xì)胞早期細(xì)胞凋亡的比例。進(jìn)一步的qRT-PCR顯示促凋亡基因如TNF-α、BAX和CASP8均上調(diào)，這表明NOLC1的過(guò)表達(dá)能使NF-κB轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)和TNF-α表達(dá)增加，這將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Western blot顯示caspase-8表達(dá)的上調(diào)和cyclin Y表達(dá)的下調(diào)，這表示NOLC1的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡與cyclin Y介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑有關(guān)，但具體機(jī)制仍未明確，需要進(jìn)一步的研究探索(結(jié)果待發(fā)表)。

3 NS1蛋白與NOLC1蛋白的相互作用

NS1蛋白是A型流感病毒唯一的非結(jié)構(gòu)蛋白，NS1蛋白在不同亞型的禽流感病毒中均有表達(dá)，高度保守。NS1具有多種功能，如抑制宿主自身細(xì)胞蛋白的合成、調(diào)節(jié)流感病毒的致病力的大小、調(diào)控宿主細(xì)胞產(chǎn)生干擾素等，還具有促進(jìn)和抑制凋亡的雙重作用[20-21]。宿主細(xì)胞被禽流感病毒侵染后，病毒的NS1與宿主細(xì)胞中的蛋白發(fā)生相互作用，通過(guò)調(diào)節(jié)宿主蛋白的分布、增強(qiáng)病毒蛋白的表達(dá)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等方式影響病毒的復(fù)制進(jìn)程。

Zhu等通過(guò)T7噬菌體展示方法篩選發(fā)現(xiàn)NS1蛋白與NOLC1蛋白間存在特異性相互作用[22]，該作用也得到了免疫共沉淀、pull down等實(shí)驗(yàn)的證實(shí)[23]。進(jìn)一步研究表明NOLC1和NS1蛋白同時(shí)表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，這為二者的相互作用奠定了空間基礎(chǔ)。Zhu等通過(guò)截短體及點(diǎn)突變等方式進(jìn)一步確定了NS1蛋白與NOLC1蛋白相互作用發(fā)生在NS1效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的第104～200位氨基酸區(qū)域[23]，并證實(shí)NS1蛋白第120位D和第195位R是參與NS1與NOLC1蛋白相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)[24]。氨基酸序列比對(duì)表明第120位D和第195位R在A型流感病毒不同亞型NS1蛋白中具有高度保守性，由此可見(jiàn)NS1-NOLC1相互作用在所有A型流感病毒中具有普遍性。

4 NOLC1蛋白對(duì)流感病毒感染過(guò)程的影響

流感病毒的感染過(guò)程包括病毒侵入、病毒復(fù)制和宿主細(xì)胞對(duì)病毒的免疫反應(yīng)等幾方面。NS1蛋白在病毒復(fù)制及應(yīng)對(duì)宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，鑒于NS1蛋白和NOLC1蛋白存在相互作用，而且NOLC1蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)中扮演重要角色，兩者的相互作用必然影響病毒的復(fù)制進(jìn)程。

4.1 NOLC1蛋白在流感病毒侵入后對(duì)宿主細(xì)胞的影響

研究表明NOLC1蛋白與NS1相互作用后會(huì)促進(jìn)流感病毒敏感細(xì)胞A549細(xì)胞的凋亡，NS1蛋白與NOLC1蛋白作用強(qiáng)度越大，引起宿主細(xì)胞凋亡程度越高。研究表明，這與CK2存在一定的關(guān)系，CK2能夠通過(guò)磷酸化一系列細(xì)胞凋亡相關(guān)因子發(fā)揮其抗凋亡的作用，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，抑制或過(guò)表達(dá)CK2都會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)周期及凋亡情況，因此CK2被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的抑制劑之一，與多種癌癥相關(guān)。NOLC1含有多個(gè)CK2特異的磷酸化位點(diǎn)，CK2對(duì)NOLC1廣泛磷酸化后，磷酸化的NOLC1又可以與CK2發(fā)生相互作用從而抑制CK2活性[25]。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NS1與NOLC1相互作用還會(huì)抑制CK2的表達(dá)，因此可以推斷NS1與NOLC1相互作用在降低CK2表達(dá)量的同時(shí)還抑制了其活性，從而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。

4.2 NOLC1蛋白對(duì)流感病毒復(fù)制的影響

禽流感病毒的感染開(kāi)始于病毒表面HA與細(xì)胞表面唾液酸α-2,3或α-2,6受體糖蛋白的結(jié)合，通過(guò)內(nèi)吞作用使病毒進(jìn)入受體細(xì)胞[26]。在內(nèi)體小泡內(nèi)，病毒粒子HA蛋白被蛋白酶水解，構(gòu)象發(fā)生改變使得位于HA N端的融合肽暴露，促使病毒囊膜與內(nèi)體小泡進(jìn)行膜融合，病毒的核糖核蛋白體(vRNP)復(fù)合物從病毒內(nèi)釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核。vRNP在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[27-28]。病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制需要依賴(lài)病毒的RNA依賴(lài)性RNA聚合酶(RdRp)，Rdrp是由PA、PB1和PB2蛋白質(zhì)組成的三聚體復(fù)合物，RdRp與核蛋白NP一起構(gòu)成病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制的最小單位。病毒RNA轉(zhuǎn)錄出互補(bǔ)的正義RNA鏈并以此為模板復(fù)制出更多的病毒RNA作為子代病毒的基因組[29-30]。同時(shí)病毒轉(zhuǎn)錄出mRNA，并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)翻譯，所翻譯出的PA、PB1、PB2和NP等蛋白重新進(jìn)入細(xì)胞核，與病毒子代RNA結(jié)合形成子代vRNPs，隨后vRNP將會(huì)在核輸出蛋白(NEP)和基質(zhì)蛋白1(M1)的協(xié)助下轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行包裝。所表達(dá)的病毒胞膜蛋白NA、HA和M2在高爾基體內(nèi)修飾后嵌入細(xì)胞膜內(nèi)，M1協(xié)助vRNP和成熟的胞膜蛋白組成子代病毒顆粒并出芽，最后，由NA蛋白切割宿主細(xì)胞膜與病毒囊膜之間連接的唾液酸受體糖蛋白，將吸附在宿主細(xì)胞膜上的子代病毒粒子釋放出來(lái)[31]。

研究發(fā)現(xiàn)，NS1與NOLC1相互作用能夠影響病毒的復(fù)制。通過(guò)進(jìn)行NOLC1的敲降和過(guò)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)NOLC1能夠促進(jìn)病毒的復(fù)制，而敲降NOLC1穩(wěn)轉(zhuǎn)株則抑制流感病毒的復(fù)制，這表示病毒的復(fù)制水平與宿主內(nèi)NOLC1的表達(dá)量存在正相關(guān)的關(guān)系。由此可以推測(cè)，病毒進(jìn)入細(xì)胞后，NS1通過(guò)與NOLC1結(jié)合影響了NOLC1的正常功能，從而降低了細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制水平。進(jìn)一步研究表明，在禽流感病毒感染宿主細(xì)胞后的48 h內(nèi)，NOLC1 mRNA的表達(dá)量整體呈下降趨勢(shì)。這說(shuō)明病毒不但通過(guò)NS1的結(jié)合抑制了NOLC1，而且還通過(guò)其他方式降低NOLC1的表達(dá)量從而進(jìn)一步影響了NOLC1的功能(結(jié)果待發(fā)表)。鑒于NOLC1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的功能，可以推斷NS1與NOLC1的結(jié)合干擾了NOLC1的正常功能，促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡，從而影響了病毒的復(fù)制。另一方面，NOLC1具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的功能，NS1與NOLC1相互作用可能會(huì)影響宿主細(xì)胞內(nèi)某些抗病毒反應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)或某些與炎癥發(fā)生相關(guān)的信號(hào)通路，從而影響宿主細(xì)胞的天然免疫反應(yīng)，影響病毒復(fù)制。這些問(wèn)題的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究闡明。

5 展 望

禽流感是一種四季均可發(fā)病且具有嚴(yán)重預(yù)后的傳染病之一，因此防控其發(fā)生及疾病治療十分重要。禽流感病毒自身表達(dá)的非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)作為影響病毒復(fù)制的重要蛋白，是唯一不包裝到病毒顆粒的蛋白，并大量產(chǎn)生于感染細(xì)胞中，其能夠與宿主細(xì)胞內(nèi)如NOLC1蛋白等多種蛋白發(fā)生相互作用，是決定病毒感染能力的重要因素。人核仁磷酸化蛋白NOLC1，是一個(gè)高度磷酸化的哺乳動(dòng)物蛋白，在細(xì)胞中與RNA聚合酶I相互結(jié)合，參與核仁的發(fā)生，調(diào)節(jié)rDNA(核糖體DNA)的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)也參與到炎癥發(fā)生、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生等相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控，對(duì)細(xì)胞生命周期在時(shí)間上的長(zhǎng)短調(diào)控起到了十分重要的作用，這些細(xì)胞活動(dòng)均與病毒感染有著密不可分的聯(lián)系，因此對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)和NOLC1的研究在甲型禽流感病毒的致病機(jī)理、傳播及治療等眾多領(lǐng)域都具有深遠(yuǎn)而重大的意義。

我們依據(jù)現(xiàn)有的研究證明NS1與NOLC1的相互作用能夠影響宿主細(xì)胞凋亡和病毒的復(fù)制，這只能在現(xiàn)象上說(shuō)明NOLC1會(huì)影響流感病毒感染宿主細(xì)胞的進(jìn)程，但更為精細(xì)的分子機(jī)制還需要深入研究。為了進(jìn)一步明確NOLC1蛋白在禽流感病毒感染過(guò)程中的作用，我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)室前期研究成果基礎(chǔ)上擬通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)(即感染性克隆)拯救出NS1基因定點(diǎn)突變的甲型禽流感病毒，通過(guò)比較野生型病毒和突變病毒，在活病毒水平探究NS1與NOLC1的相互作用對(duì)病毒復(fù)制增殖、宿主細(xì)胞活性及細(xì)胞周期的影響。明確NOLC1蛋白在流感病毒感染過(guò)程中的作用及方式，將進(jìn)一步揭示流感病毒感染宿主細(xì)胞的分子機(jī)制，并為新的抗流感病毒藥物的研發(fā)提供新的靶點(diǎn)和方向。

另一方面，由于NOLC1蛋白是人體細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控的一類(lèi)非常重要的蛋白，病毒感染后NOLC1和NS1兩蛋白的相互作用必然對(duì)諸多細(xì)胞活動(dòng)造成影響，比如對(duì)炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路的影響，與NS1作用后能否繼續(xù)與IP6共同對(duì)蛋白激酶CK2有調(diào)控作用，以及感染后NOLC1對(duì)端粒重復(fù)結(jié)合因子(TRF2)的調(diào)節(jié)等等。目前，NOLC1蛋白的分子功能研究報(bào)道較少，因此其對(duì)流感病毒感染影響的機(jī)制還有很多可深入研究的內(nèi)容，探明NOLC1對(duì)這些信號(hào)調(diào)控的具體分子機(jī)制不但具有一定的理論意義，而且能夠?yàn)樾碌目共《舅幬锏脑O(shè)計(jì)提供依據(jù)，具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。