劉東讓 侯喜林 肖棟

摘要：以1年生的油用型品種Yellow sarson（YS-143）與2年生的蕪菁品種Vegetable turnip（VT-044）的cDNA為模板，克隆出CCA1基因cDNA全長(zhǎng)序列，分析其核苷酸多態(tài)性。在這2份材料構(gòu)建的200株F2分離群體中，選取極早和極晚開(kāi)花的單株各24株，對(duì)在親本上鑒定到的4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用Pearson相關(guān)性分析研究基因型與開(kāi)花時(shí)間表現(xiàn)型的關(guān)系。構(gòu)建pEZS-NL-CCA1載體，利用亞細(xì)胞定位技術(shù)，分析CCA1基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況。序列分析表明，YS-143與VT-044分別有1 665、1 647個(gè)核苷酸，分別編碼了554、548個(gè)氨基酸。親本之間核苷酸序列分析鑒定到12個(gè)差異位點(diǎn)，氨基酸同源進(jìn)化樹(shù)分析表明，十字花科的不結(jié)球白菜、大白菜、蘿卜、油菜、擬南芥、亞麻芥聚集在同一分支中，而禾本科的大麥、玉米、水稻聚集在另一分支中。在F2分離群體上，Pearson相關(guān)性鑒定到位于親本第727至第732個(gè)堿基處的1個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（ACCCTT/ACCCTT），有該位點(diǎn)的群體單株平均開(kāi)花時(shí)間為39 d，極顯著早于缺失該位點(diǎn)的群體單株平均開(kāi)花時(shí)間104 d（P<0.01），表明白菜類(lèi)作物CCA1基因的第727至第732個(gè)堿基的缺失（A05：472204-472209）與開(kāi)花時(shí)間呈極顯著相關(guān)，影響開(kāi)花時(shí)間，可為光周期敏感的白菜類(lèi)作物晚抽薹育種研究提供一定的理論依據(jù)。開(kāi)發(fā)的該Insert/Delete（InDel）標(biāo)記，可以作為功能分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種工作，以加快育種進(jìn)程。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，CCA1基因主要在細(xì)胞核上表達(dá)。

關(guān)鍵詞：白菜類(lèi)作物;開(kāi)花時(shí)間;CCA1;InDel標(biāo)記;亞細(xì)胞定位

中圖分類(lèi)號(hào)： S634.01?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）20-0084-07

白菜類(lèi)作物（Brassica rapa）屬于十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica），是我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)重要的蔬菜和油料作物，主要包括大白菜、小白菜、蕪菁、菜薹、紫菜薹、白菜型油菜等多種類(lèi)型[1]。油用白菜類(lèi)作物包括春性和冬性歐洲生態(tài)類(lèi)型、我國(guó)特有的白菜型油菜和印度的Sarson類(lèi)型，以根莖膨大為主要特征的蕪菁類(lèi)型是較原始的白菜類(lèi)作物栽培種[2]。白菜類(lèi)作物在開(kāi)花習(xí)性上有1年生和2年生之分，在抽薹、開(kāi)花時(shí)間上存在很大的差異。因此，白菜類(lèi)作物是研究抽薹、開(kāi)花變異、育種和遺傳的良好體系[3]。

開(kāi)花時(shí)間是白菜類(lèi)作物生產(chǎn)中重要的農(nóng)藝性狀，是其從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的重要標(biāo)志，先抽薹、開(kāi)花的現(xiàn)象直接影響了其產(chǎn)量和品質(zhì)[4-5]。開(kāi)花時(shí)間是由其內(nèi)源發(fā)育信號(hào)和多種環(huán)境因素共同調(diào)控的，其中環(huán)境溫度和光周期是主要影響因子[6]。Nelson等對(duì)起源于歐洲和澳大利亞的1年生夏季甘藍(lán)型油菜進(jìn)行了光周期敏感性觀察，同時(shí)對(duì)不同光周期（長(zhǎng)日照、短日照）條件下的131份雙單倍體（double haploid）群進(jìn)行了開(kāi)花時(shí)間（天數(shù)）和開(kāi)花時(shí)葉片數(shù)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該親本及群體開(kāi)花時(shí)間受光周期影響[7]。Huang等的研究表明，植物開(kāi)花的光周期調(diào)控途徑涉及復(fù)雜的晝夜節(jié)律（生物鐘）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，晝夜節(jié)律（生物鐘）核心振蕩子包括CCA1和LATEELONGATEDHYPOCOTYL（LHY）等MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子[8]。在擬南芥中，CCA1基因通過(guò)與TIMING OF CABEXP RESSION 1（TOC1）和LHY基因相互作用形成一個(gè)生物鐘的反饋環(huán)，即CCA1和LHY基因表達(dá)達(dá)到一定量會(huì)抑制TOC1基因的表達(dá)，而TOC1基因表達(dá)量升高則會(huì)促進(jìn)CCA1和LHY基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植物對(duì)晝夜變化做出響應(yīng)，是維持生物鐘節(jié)律的必需組分[9-11]。研究者已經(jīng)在蕓薹屬的多種類(lèi)型中測(cè)序發(fā)現(xiàn)，CCA1存在多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，表明CCA1序列變異可用于開(kāi)發(fā)與育種性狀相關(guān)的分子標(biāo)記[12]。張志剛等利用CCA1基因在2個(gè)敏感性不同的大白菜品種上第329 bp（第4外顯子）處和第1 407 bp（第7外顯子）處的2段序列差異開(kāi)發(fā)出2個(gè)InDel標(biāo)記，用于區(qū)分2個(gè)大白菜品種的耐抽薹性[13]。Yi等對(duì)3個(gè)蕪菁自交系（RCBr、Kenshin 和Chiifu）的DNA序列進(jìn)行分析，在CCA1基因第4內(nèi)含子上開(kāi)發(fā)出1個(gè)InDel標(biāo)記[12]。白菜類(lèi)作物種類(lèi)繁多，僅在大白菜和蕪菁上進(jìn)行克隆序列的比較和標(biāo)記的開(kāi)發(fā)具有一定局限性，而且一般認(rèn)為外顯子上的變異比內(nèi)含子上的變異更有可能影響植物的表型。在我國(guó)春季及高寒地區(qū)的秋冬白菜類(lèi)作物生產(chǎn)中，先期抽薹、開(kāi)花常常成為降低蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)的重要難題[1]。因此，選育耐抽薹、晚開(kāi)花的優(yōu)質(zhì)新品種，已經(jīng)成為白菜類(lèi)作物育種中的重要目標(biāo)，開(kāi)發(fā)白菜類(lèi)作物不同類(lèi)型CCA1基因的分子標(biāo)記，可為分子標(biāo)記輔助育種提供一定的理論依據(jù)[14]。

本研究選用早開(kāi)花的油用型品種YS-143與晚開(kāi)花的蕪菁品種VT-044為試材，分別觀察其在長(zhǎng)日照和短日照2個(gè)條件下的開(kāi)花時(shí)間，同時(shí)以這2個(gè)材料為模板克隆CCA1基因的cDNA序列，并利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析，開(kāi)發(fā)出1個(gè)InDel標(biāo)記，最后通過(guò)驗(yàn)證，將其作為功能標(biāo)記進(jìn)行輔助育種工作，同時(shí)利用亞細(xì)胞定位技術(shù)鑒定了CCA1基因在細(xì)胞中的表達(dá)位置。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

以白菜類(lèi)作物中純合的1年生油用型品種YS-143（B. rapa L. ssp. oleifera）和2年生蕪菁品種VT-044（B. rapa L. em. Metzg. ssp. rapa）及它們構(gòu)建的F2分離群體為試材。親本用于不同光周期對(duì)開(kāi)花時(shí)間的敏感性觀察及鑒定多態(tài)性差異位點(diǎn)，F(xiàn)2代分離群體用于多態(tài)性差異位點(diǎn)的驗(yàn)證。

RNAsimple Total RNA Kit試劑盒、PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，購(gòu)自TaKaRa公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自Axygen公司;pEAZY-Blunt載體及大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;高保真酶MIX（Ⅰ-5TM2×High-Fidelity Master Mix）購(gòu)自江蘇南京擎科生物科技有限公司;JS-3000全自動(dòng)凝膠成像分析儀，購(gòu)自上海培清科技有限公司。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?光周期敏感試驗(yàn)?2017年8月3號(hào)，將親本材料種子20粒分別在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿里催芽，25 ℃暗培養(yǎng)36 h后播種在穴盤(pán)里，分別置于長(zhǎng)日照（光照16 h/黑暗8 h）、短日照（光照8 h/黑暗16 h），溫度22 ℃/18 ℃，相對(duì)濕度70%，光照度72 μmol/（m2·s）的光培箱中生長(zhǎng)，1個(gè)月后定植花盆（17 cm）。同時(shí)，將F2代分離群體200株也播種在穴盤(pán)中，置于塑料大棚生長(zhǎng)3周以后，于2017年8月24日至12月26日定植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)句容農(nóng)博園塑料大棚內(nèi)，按照單株順序編號(hào)，正常田間管理。調(diào)查親本和F2代分離群體的開(kāi)花時(shí)間，調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)為從催芽到第1朵花開(kāi)放所需要的時(shí)間（天數(shù)）。

1.2.2?CCA1基因克隆?使用RNAsimple Total RNA Kit試劑盒提取2個(gè)親本的總RNA，具體方法參照說(shuō)明書(shū)。cDNA使用PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成，作為基因克隆所需的模板。CCA1基因序列參照已發(fā)表的大白菜基因組序列（http：//brassicadb.org/brad/），使用在線軟件Primer 3（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增的PCR引物，并由江蘇南京擎科生物科技有限公司合成（表1）。PCR擴(kuò)增體系總體積為40 μL：正反引物各 2 μL、模板cDNA 1 μL、高保真酶MIX 20 μL、ddH2O 15 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸10 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min;10 ℃保存。cDNA質(zhì)量的檢驗(yàn)采用瓊脂糖凝膠電泳方法，取5 μL DNA加入6×Loading Buffer后用1.2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，GelRed染色，用JS-3000全自動(dòng)凝膠成像分析儀進(jìn)行凝膠照相。凝膠回收方法參照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒。目的片段膠回收后連接到pEAZY-Blunt載體上，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，選擇陽(yáng)性單克隆送至江蘇南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3?序列分析?用BioXM 2.7軟件分析2份材料CCA1基因序列的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）。不同物種CCA1基因的氨基酸序列從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索獲得;同源性計(jì)算利用NCBI網(wǎng)站BLAST程序;氨基酸編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)等通過(guò)在線軟件ProtParam（https：//web. expasy.org/Protparam/）完成;親/疏水性預(yù)測(cè)采用ProtScale（https：//web. expasy.org/protscale/）;信號(hào)肽預(yù)測(cè)采用SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）;跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)采用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析采用InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）;蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用PSIPRED（http：// bioinf.cs.ucl.ac.uk /psipred/）等在線工具;多重序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建通過(guò)DNAMAN 5.2進(jìn)行[15]。

1.2.4?功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)?提取F2代群體極早和極晚開(kāi)花植株各24株葉片的DNA，具體方法參照Axygen植物基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。對(duì)親本中鑒定到的CCA1編碼區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)（InDels）設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送江蘇南京擎科生物科技有限公司測(cè)序（表1）。采用t測(cè)驗(yàn)分析親本的開(kāi)花時(shí)間差異顯著性。以InDel標(biāo)記基因型作為自變量，采用單因素方差分析候選標(biāo)記（InDel）與開(kāi)花時(shí)間表型的相關(guān)性，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析過(guò)程中所用的軟件是SPSS 19.0。

1.2.5?CCA1基因的亞細(xì)胞定位分析?根據(jù)YS-143中克隆出的CCA1基因序列和亞細(xì)胞定位載體pEZS-NL序列，設(shè)計(jì)含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)的特異引物（表1）。用One Step Cloning Kit構(gòu)建載體pEZS-NL-CCA1，具體操作方法參照說(shuō)明書(shū)。用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞[16]，取洋蔥表皮，將其靠葉肉面向上鋪于MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 h待用，取8 μL金粉懸浮液于1.5 mL離心管中，依次加入5 μg質(zhì)粒DNA、50 μL 2.5 mol/L CaCl2、20 μL 0.1 mol/L亞精胺，冰浴20 min，其間間歇振蕩混勻。10 000 r/min離心5 s，棄上清，加入無(wú)水乙醇漂洗2次，棄上清，最后加入20 μL無(wú)水乙醇，懸浮待用。用基因槍轟擊洋蔥表皮，轟擊后暗培養(yǎng)16 h制片，用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，并拍照記錄。

2?結(jié)果與分析

2.1?親本開(kāi)花時(shí)間統(tǒng)計(jì)

由圖1可知，10株親本材料YS-143在長(zhǎng)日照條件下平均開(kāi)花時(shí)間為（48±10） d，短日照條件下為（96±10） d;10株VT-044在長(zhǎng)日照條件下平均開(kāi)花時(shí)間為（105±15） d，短日照條件下在統(tǒng)計(jì)時(shí)間內(nèi)沒(méi)有開(kāi)花，記為200 d。通過(guò)t測(cè)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)親本在不同光周期處理下的開(kāi)花時(shí)間均差異極顯著。由此證明，2個(gè)親本開(kāi)花時(shí)間均受光周期影響，均為光周期敏感性材料。

2.2?CCA1基因克隆及序列分析

由圖2可知，YS-143的cDNA序列長(zhǎng)度為1 665 bp，VT-044的序列長(zhǎng)度為1 647 bp，除了前者比后者多了4段共18 bp的插入外，整個(gè)編碼區(qū)還有8處SNPs，其中2處是非同義突變。經(jīng)預(yù)測(cè)，第1段插入使YS-143的CCA1蛋白第110位后的氨基酸插入Arg和Lys 2個(gè)殘基;第2段插入使 YS-143的CCA1蛋白第242位后的氨基酸插入Thr和Leu 2個(gè)殘基;第3段使YS-143的CCA1蛋白第263位后的氨基酸插入Gly殘基;第4段使YS-143的CCA1蛋白第504位后的氨基酸插入Leu殘基;另外2處非同義突變分別是 YS-143 的CCA1蛋白第158位氨基酸由Val突變?yōu)長(zhǎng)eu、第467位氨基酸由Gln突變?yōu)長(zhǎng)ys。

由圖3可知，YS-143的基因序列包含1個(gè)長(zhǎng)為1 665 bp的ORF;該基因編碼554個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其編碼蛋白質(zhì)化學(xué)式為C2591H4095N781O867S14，相對(duì)分子質(zhì)量為60.5 ku，理論等電點(diǎn)為6.20，不穩(wěn)定指數(shù)為46.60，脂肪指數(shù)為57.33。ProtScale親/疏水性預(yù)測(cè)顯示，該蛋白屬于親水性蛋白，平均親水指數(shù)為-0.872。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其主要為α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲，分別占21.01%、76.45%，其余為延伸鏈。VT-044 的基因序列包含1個(gè)長(zhǎng)為1 647 bp的ORF;該基因編碼548個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其編碼蛋白質(zhì)化學(xué)式為 C2559H4033N771O861S14，相對(duì)分子質(zhì)量為59.8 ku，理論等電點(diǎn)為5.98，不穩(wěn)定指數(shù)為46.18，脂肪指數(shù)為56.35。ProtScale親/疏水性預(yù)測(cè)顯示，該蛋白屬于親水性蛋白，平均親水指數(shù)為 -0.877。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其主要為α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲，分別占23.5%、73.59%，其余為延伸鏈。2個(gè)基因所編碼蛋白質(zhì)均屬于不穩(wěn)定蛋白，無(wú)信號(hào)肽和分泌蛋白，也不存在跨膜區(qū)域，并且均在第19至第73氨基酸區(qū)域內(nèi)有3個(gè)MYB-DNA結(jié)合域。

2.3?CCA1基因編碼的氨基酸序列同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用BLASTp分別對(duì)YS-143和VT-044的CCA1氨基酸序列進(jìn)行同源性檢索與多重比對(duì)，結(jié)果（圖4、圖5）顯示它們與大白菜（登錄號(hào)為XP_009142594.1）相似性接近100%，與甘藍(lán)型油菜（登錄號(hào)為XP_013712324.1）和蘿卜（登錄號(hào)為XP_018441166.1）相似性分別為92%、73%，與擬南芥（登錄號(hào)為NP850460.1）和亞麻芥（登錄號(hào)為XP_010518363.1）相似性在65%以上，其中N端的MYB-DNA結(jié)合域的氨基酸序列相似度接近100%;與大麥（登錄號(hào)為BAJ92173.1）、玉米（登錄號(hào)為BAJ92173.1）和水稻（登錄號(hào)為AAR20887）的相似性均在35%以下，表明同科植物的氨基酸序列相似度較高。同源進(jìn)化樹(shù)分析表明，十字花科的不結(jié)球白菜、大白菜、蘿卜、甘藍(lán)型油菜、擬南芥、亞麻芥聚集在同一分支中，而禾本科的大麥、玉米、水稻聚集在另一分支中。

2.4?功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)

將4個(gè)InDel標(biāo)記在極早和極晚開(kāi)花植株上的測(cè)序結(jié)果與植株開(kāi)花時(shí)間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)第2處標(biāo)記（第727至第732個(gè)堿基的缺失）與材料開(kāi)花時(shí)間關(guān)聯(lián)極顯著，其余3處不顯著。測(cè)序發(fā)現(xiàn)在F2代的24株極早開(kāi)花的植株中，該位點(diǎn)基因型為ACCCTT/ACCCTT的有18株（與早花型母本YS-143一致），占總株數(shù)的75%，開(kāi)花時(shí)間為31～56 d，平均開(kāi)花時(shí)間39 d，基因型為ACCCTT/-的有3株，-/-的有3株;在24株極晚開(kāi)花的植株中，該位點(diǎn)基因型為ACCCTT/ACCCTT的有0株，ACCCTT/-的有4株，基因型為-/-的有20株（與晚花型父本VT-044一致），占總株數(shù)的83%，開(kāi)花時(shí)間為84～114 d，平均開(kāi)花時(shí)間為104 d。因此，該位點(diǎn)基因型為ACCCTT/ACCCTT的植株開(kāi)花時(shí)間遠(yuǎn)早于基因型為-/-的植株的開(kāi)花時(shí)間，兩者之間呈極顯著差異（P<0.01）（圖6）。該InDel標(biāo)記基因型和開(kāi)花時(shí)間表型的Pearson相關(guān)性分析表明，材料開(kāi)花時(shí)間的早晚與基因型呈極顯著相關(guān)（r=0.991，P<0.01）。表明CCA1基因的第727至第732個(gè)堿基的變異（A05：472204-472209）與開(kāi)花時(shí)間呈極顯著相關(guān)，會(huì)影響植株的開(kāi)花時(shí)間，可以為白菜類(lèi)作物光周期影響開(kāi)花時(shí)間的研究提供理論依據(jù)。同時(shí)，該位點(diǎn)可以作為功能分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種工作，加快育種進(jìn)程。

2.5?CCA1基因的亞細(xì)胞定位分析

利用亞細(xì)胞定位在線預(yù)測(cè)軟件WoLF PSORT（http：//www.genscript.com/psort.html）對(duì)CCA1基因在細(xì)胞中表達(dá)的位置進(jìn)行預(yù)測(cè)，顯示CCA1基因有91.3%的可能性定位在細(xì)胞核上。而通過(guò)在洋蔥表皮中進(jìn)行的亞細(xì)胞定位試驗(yàn)（圖7）發(fā)現(xiàn)，在陽(yáng)性對(duì)照中，細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上都能觀察到綠色熒光?而來(lái)源YS-143的CCA1蛋白的熒光信號(hào)主要集中在細(xì)胞核上，說(shuō)明CCA1基因主要在細(xì)胞核上發(fā)揮功能。

3?討論與結(jié)論

在光周期條件下，白菜類(lèi)作物具有不同的敏感性反應(yīng)。張學(xué)銘對(duì)100份白菜類(lèi)作物抽薹開(kāi)花性狀的光周期敏感性進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)具有較大差異[3]。本研究所用材料YS-143在長(zhǎng)日照條件下平均開(kāi)花時(shí)間為（48±10） d，短日照條件下為（96±10） d;VT-044在長(zhǎng)日照條件下平均開(kāi)花時(shí)間為（105±15） d，短日照條件下在統(tǒng)計(jì)時(shí)間內(nèi)沒(méi)有開(kāi)花。因此，選取的YS-143和VT-044均為光周期敏感類(lèi)型，可以作為試驗(yàn)材料進(jìn)行光周期變化對(duì)開(kāi)花時(shí)間影響的研究。

研究者分別從楊樹(shù)、大麥、玉米等植物中克隆到了相應(yīng)的CCA1基因，分子進(jìn)化關(guān)系表明，它們之間氨基酸序列的同源性較高，且在單、雙子葉植物間非常保守，其N(xiāo)端的核酸結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相似度高達(dá)79%以上[17-19]。這與本研究結(jié)果類(lèi)似，筆者也發(fā)現(xiàn)2個(gè)材料與大白菜、甘藍(lán)型油菜、蘿卜的基因序列具有較高同源性，與擬南芥、亞麻芥的進(jìn)化距離也較近，其中N端的核酸結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相似度接近100%。Yi等對(duì)來(lái)自3個(gè)蕪菁自交系（RCBr、Kenshin、Chiifu）的CCA1基因序列進(jìn)行了分析，在第4內(nèi)含子上鑒定出高水平的序列變異，并據(jù)此開(kāi)發(fā)出1個(gè)InDel標(biāo)記，進(jìn)而分別用PCR及HRM（high-resolution melting）技術(shù)2種方法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，均證明該第4內(nèi)含子上的序列變異可以作為InDel分子標(biāo)記參[CM（25]與蕪菁的育種工作[12]。張志剛等在2個(gè)大白菜品種上克隆CCA1基因的cDNA序列，分別在329 bp（第4外顯子）處和第1 407 bp（第7外顯子）處開(kāi)發(fā)出2個(gè)InDel分子標(biāo)記，并利用PCR法進(jìn)行了驗(yàn)證[13]。本研究選擇更有可能對(duì)植物表型造成影響的外顯子序列進(jìn)行分析，將分別在第330 bp（第4外顯子）、第726 bp（第6外顯子）、第789 bp（第6外顯子）和第1 515 bp（第7外顯子）處鑒定到的4段序列差異與F2代分離群體的開(kāi)花時(shí)間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)位于第726 bp處的序列差異與開(kāi)花時(shí)間相關(guān)，其余3段不相關(guān)。其中第4外顯子上的序列差異與張志剛等鑒定到的序列[13]位置相近、序列相同。同時(shí)筆者也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2群體中基因型為ACCCTT/ACCCTT的植株的開(kāi)花時(shí)間并不是都早于基因型為-/-的植株。其主要原因可能是開(kāi)花時(shí)間并不只受CCA1基因控制，而是受多個(gè)開(kāi)花時(shí)間相關(guān)基因和多條路徑相互協(xié)調(diào)、共同調(diào)控的。在擬南芥中，發(fā)現(xiàn)CCA1基因定位在細(xì)胞核上[20]。本研究通過(guò)亞細(xì)胞定位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不結(jié)球白菜YS-143中的CCA1基因在細(xì)胞核上表達(dá)，表明在擬南芥到白菜類(lèi)作物進(jìn)化過(guò)程中，CCA1基因依然在細(xì)胞核中發(fā)揮原有的作用。

已有研究指出，在現(xiàn)代育種中改良某個(gè)特定的優(yōu)良性狀最有效的途徑就是選擇攜帶某一性狀的目的基因的供體親本進(jìn)行回交，同時(shí)利用各種分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，迅速地將與分子標(biāo)記連鎖的基因轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)品種上，從而顯著加速育種年限[21]。本研究關(guān)于CCA1基因功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與利用，可為白菜類(lèi)作物分子標(biāo)記輔助育種提供一定的理論依據(jù)和現(xiàn)實(shí)意義，為開(kāi)發(fā)通用的白菜類(lèi)作物InDel標(biāo)記提供了重要的一步。

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