崔華威 陶飛 苗愛敏

摘要：種子發(fā)芽率是種子檢驗中的一個重要指標，無損、快速、準確地進行發(fā)芽率測定具有重要意義。綜述了種子發(fā)芽率無損檢測方法的研究進展，重點介紹了這些方法的原理、優(yōu)點及在實際檢測當中的應用效果，預測了發(fā)芽率無損檢測發(fā)展方向，以期為相關工作提供科學依據(jù)和參考。

關鍵詞：種子發(fā)芽率;無損檢測;研究進展

中圖分類號： S330.2?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0009-04

種子發(fā)芽率是種子檢驗中的重要指標，發(fā)芽率的高低與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和種子經(jīng)營有著密切的關系，在確定播種量以及種子生理研究方面具有重要的作用[1]。目前，測定種子發(fā)芽率的主要方法有直接測定法和間接測定法，其中直接測定法是通過標準發(fā)芽試驗來測定種子發(fā)芽率，而間接測定法則是通過測定種子物理、化學、生理特性等指標來間接估測發(fā)芽率[2]。

直接測定法根據(jù)國家標準或相關規(guī)程規(guī)定的條件，在人工氣候箱中進行試驗，過程大多需要1～2周時間，檢測結果準確，重復性好，在種子質(zhì)量檢驗中被廣泛應用。但是，該方法費時費力，不能迅速取得結果，特別是對于休眠期長的種子[1]。另外，在大批量的種子采收、購銷和調(diào)運中，往往因時間緊、任務重而來不及進行發(fā)芽試驗。因此，選用間接測定法快速測定發(fā)芽率具有重要意義。

本文介紹種子發(fā)芽率間接測定方法，重點綜述其中的無損檢測方法，包括無損檢測的原理、優(yōu)點以及實際應用效果，并預測發(fā)芽率無損檢測發(fā)展方向，以期為相關工作提供科學依據(jù)和參考。

1?種子發(fā)芽率快速測定方法

傳統(tǒng)的種子發(fā)芽率快速測定方法有染色法、電導率法、吸脹狀態(tài)法、酶學方法等。其中，氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法和酶學方法簡便準確，應用廣泛[1]。

染色法為使用TTC、刃天青和紅墨水等對種子進行染色，觀察不同活力種子染色效果的差異，探尋其與種子發(fā)芽率之間關聯(lián)[3-4]。電導率法基于不同裂變程度稻種膜結構完整性不同造成的電解質(zhì)滲透差異，間接獲取種子內(nèi)部生化信息，然后對發(fā)芽率進行預測[5]。

種子在發(fā)芽吸脹初期的細胞膜重建和損傷修復能力影響電解質(zhì)和可溶性物質(zhì)外滲的程度，高活力種子細胞膜重建和損傷修復能力強，種子浸泡液的電導率低，電導率與發(fā)芽率呈明顯的負相關關系，種子浸出液電導率測定曾被成功地應用于多種作物的種子發(fā)芽率測定[6-7]。

吸脹狀態(tài)法根據(jù)種子吸水后形態(tài)變化來判定種子活力及發(fā)芽率。有活力的種子浸入水中時，開始吸水比較緩慢，隨后會趨于平衡;沒活力的種子由于蛋白質(zhì)變性，原生質(zhì)體的透性提高，浸入水中后種子呈典型的水腫狀態(tài)。據(jù)此可根據(jù)種子吸脹后的狀態(tài)來判斷種子發(fā)芽率的高低。史兆慶采用吸脹狀態(tài)法成功測定了香椿種子發(fā)芽率[8]。但該方法適用于自身比較干燥的種子，易受溫度、種子質(zhì)量、水質(zhì)等因素影響，誤差較大。

在種子儲藏過程中，隨著種子活力的降低，與呼吸有關的酶類（如過氧化氫酶、過氧化物酶以及谷氨酸脫羧酶等）活性降低。國內(nèi)外大量研究表明，過氧化氫酶活性與種子發(fā)芽率具有極顯著的相關性，可以通過過氧化氫酶活性大小預測種子發(fā)芽率[1，9]。

上述發(fā)芽率間接測定方法雖然具有一定的適用性和準確性，但是會對種子造成破壞和損傷，檢測過的種子發(fā)芽能力喪失，或貯藏性能明顯降低。近年來，隨著科技的不斷發(fā)展，種子科學家們紛紛致力于研究無損的發(fā)芽率檢驗新技術，以期在不破壞種子結構及特性的前提下，更加準確、簡便、快捷地評價種子質(zhì)量和種用價值。

2?種子發(fā)芽率無損檢測技術

種子發(fā)芽率無損檢測方法是指在不破壞種子結構或特性的前提下，實現(xiàn)種子發(fā)芽率快速測定的方法，主要包括光譜技術、高光譜成像、質(zhì)譜技術、軟X射線造影、電子鼻、熱成像、分色法、激光散斑技術和超微弱發(fā)光等。無損檢測技術與傳統(tǒng)測定方法的關系見表1。

2.1?光譜技術

光譜學主要研究各種物質(zhì)光譜的產(chǎn)生及其同物質(zhì)之間的相互作用。光譜學技術（spectroscopy）主要包括近紅外（NIR）、

中紅外（MIR）、熒光（fluorescence）、傅里葉變換紅外（FT-IR）光譜技術以及拉曼光譜（Raman spectra）、偏振光譜（polarization spectra）技術[10]，在種子發(fā)芽率檢測中常用的方法是近紅外、偏振光譜技術。

近紅外光譜（NIRS）技術利用近紅外光照射樣品，依據(jù)某1種或多種化學成分在特定譜區(qū)的吸收特性來快速檢測其在樣品中的含量，具有方便、快速、高效、準確、成本較低、不破壞樣品、不消耗化學試劑、不污染環(huán)境等優(yōu)點。當前使用NIRS技術來分析作物種子質(zhì)量主要集中在水稻、玉米、燕麥、結縷草等作物上[11-14]。

李毅念等提出一種基于近紅外光譜技術的快速、無損測試雜交水稻種子發(fā)芽率的新方法，發(fā)芽率預測值與真實值之間的相對誤差在4.2%以內(nèi)[15]。另外2個針對稻種糙米的獨立研究也表明，可以建立基于近紅外特征光譜的糙米發(fā)芽率預測模型，模型在稻種糙米發(fā)芽率預測方面有較好的能力[11，16]。此外，研究顯示，結縷草種子的近紅外光譜值與標準發(fā)芽率之間存在回歸關系，二者之間的相關系數(shù)達到 0.987[14]?？梢?，將近紅外光譜技術應用于種子發(fā)芽率檢驗是可行的。

除了近紅外光譜技術外，還有學者利用偏振光譜技術預測稻種發(fā)芽率。偏振光譜技術是基于強度、偏振度及偏振角信息，對目標成分進行非接觸檢測的新技術。程宇瓊等提出基于連續(xù)偏振光譜技術實現(xiàn)稻種發(fā)芽率快速、無損檢測的方法[5]，利用獲取的連續(xù)偏振光譜構建稻種發(fā)芽率預測模型，結果顯示，模型預測精度較高（相關系數(shù)為0.976，相對誤差為 0.85%），利用連續(xù)偏振光譜技術也能實現(xiàn)稻種發(fā)芽率的無損、快速檢測。

2.2?高光譜成像

高光譜成像（hyperspectral imaging）是包含大量窄波段影像的成像技術，結合了傳統(tǒng)的成像和光譜學技術，能夠同時獲得檢測對象的空間和光譜信息，在種子品種識別、種子成分檢測、病蟲害檢測等方面具有很大的應用潛力[17]。

李美凌等利用高光譜圖像技術對水稻種子活力進行檢測研究，將老化48 h與未老化的稻種進行對比分析，得出高光譜技術可以用于鑒定稻種活力的結論[18]。于施淼等將南粳46水稻作為研究對象，利用高光譜成像技術預測稻種發(fā)芽率，根據(jù)稻種不同區(qū)域特征波長的光譜數(shù)據(jù)建立預測模型并加以比較，結果表明，利用高光譜成像技術檢測糙米發(fā)芽率是可行的[2]。

董高利用高光譜成像技術進行單籽粒小麥發(fā)芽預測，分析了單粒發(fā)芽與未發(fā)芽小麥籽粒之間的光譜差異，建立發(fā)芽與未發(fā)芽籽粒預測模型，二者的平均正確識別率能達到 72.5%[17]。Matzrafi等利用高光譜成像技術對長芒莧（Amaranthus palmeri）種子進行研究，發(fā)芽種子和不發(fā)芽種子的區(qū)分準確度分別為81.9%和76.4%[19]。表明利用高光譜成像技術進行單粒籽粒發(fā)芽預測存在一定可行性。

2.3?質(zhì)譜方法

質(zhì)譜法（mass spectrometry）是一種與光譜并列的譜學方法，通過電場和磁場將物體內(nèi)運動的離子按質(zhì)荷比分離并進行檢測的方法。

表面解吸常壓化學電離質(zhì)譜（DAPCI-MS）是常使用的種子發(fā)芽率無損檢測方法，可在常溫、常壓和未經(jīng)樣品預處理的前提下對樣品表面進行直接分析，具有無損、快速、能分析復雜樣品等優(yōu)點。羅麗萍等采用DAPCI-MS結合化學計量學方法，實現(xiàn)了新鮮和陳年蓮子的快速鑒別[20]。殷勤等對小?？Х确N子進行人工老化處理，得到發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)明顯不同的7份種子樣品，采用DAPCI-MS獲得咖啡種子表面的化學指紋圖譜和質(zhì)譜信息特征，結果表明，DAPCI-MS技術能有效區(qū)分7份咖啡種子[21]。

姜翠翠等利用DAPCI-MS技術測定蘿卜種子中的芥子堿含量，結果發(fā)現(xiàn)，老化程度越高，蘿卜種子中芥子堿的含量越大，蘿卜種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢相應的降低，認為芥子堿可以作為種子質(zhì)量標記物，該方法無需樣品預處理，檢測速度快，可作為新型的種子發(fā)芽率無損檢測方法[22]。

此外，質(zhì)譜法可以和色譜技術聯(lián)用，結合質(zhì)譜的高靈敏度、強鑒別能力和色譜的高分辨率，例如目前較成熟的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術，被廣泛應用于復雜組分的分離與鑒定。李海燕等將6種觀賞辣椒親本及其組配的3種F1代種子作試驗材料，采用GC-MS技術對辣椒種子中的脂肪酸成分進行分析及鑒定，發(fā)現(xiàn)種子發(fā)芽率與棕櫚酸含量、硬脂酸含量存在極顯著負相關性，在辣椒生產(chǎn)栽培中可以通過檢測脂肪酸含量快速測定種子發(fā)芽率[23]。

2.4?軟X射線造影

軟X射線造影（soft X-ray imaging）是利用長波X射線的一種透視攝影，具有射線能級弱、成像清晰、分辯力高等特點。隨著X射線機的發(fā)展和造影技術的進步，這一技術的應用越來越廣泛，如醫(yī)學中對軟組織腫瘤的診斷、輕薄金屬及非金屬的探傷以及文物考古等。20世紀60年代以來，種子科技領域開始引進并應用這一技術[24]。

軟X射線造影早期主要被用于查定空粒和蟲害粒種子[25]，之后開始被用于種子發(fā)芽率檢測研究。顧德發(fā)通過小麥種子軟X射線膠片判讀出的發(fā)芽率與實際發(fā)芽率之間無顯著差異[24]。鄭郁善等使用軟X射線儀對殼斗科14個樹種的536份種子進行研究，結果表明，各樹種種子的X光膠片判讀值與實際發(fā)芽率之間沒有顯著差異[26]。此外，針對甜椒種子、小桐子種子和油松種子的研究也表明，可以根據(jù)X射線圖像判讀值來預測種子的發(fā)芽率[25，27-28]。

2.5?電子鼻

電子鼻（electronic nose）技術是利用氣體傳感器陣列識別氣味的電子系統(tǒng)，它可以實時、連續(xù)地監(jiān)測特定部位的氣味狀況。與普通化學分析儀器不同，通過該技術得到的不是被測樣品中某種或某幾種成分的定性與定量結果，而是樣品中揮發(fā)成分的整體信息，也稱“指紋”數(shù)據(jù)[29]。

Jonsson等提出將電子鼻技術用于谷物品質(zhì)檢測的方法，通過對微生物活動時釋放出的氣味進行檢測，實現(xiàn)了對谷物品質(zhì)的預測[30]。程紹明等利用電子鼻技術對發(fā)芽率分別為90%、80%、70%、60%、50%和0的6個番茄種子樣品進行分析，結果表明，電子鼻技術可以很好地區(qū)分出番茄種子發(fā)芽率為90%、80%、50%～70%和不發(fā)芽4種情況;當種子發(fā)芽率為70%、60%、50%時，其圖形信息部分重疊，利用電子鼻技術較難將其區(qū)分開[31]，表明該技術目前在種子發(fā)芽率預測方面還處于起步階段，準確度還有待提高。

2.6?熱成像

熱成像（thermal imaging）又稱紅外熱成像（簡稱TIS），是指利用紅外探測器和光學成像物鏡獲得物體表面紅外熱像圖的技術，圖像上不同顏色代表被測物體的不同溫度。TIS可以清晰、準確、直觀地提取物體表面溫度幅度與分布的微小變化，觀察到人眼無法觀測到的物體外形輪廓或表面熱分布[32]。

研究表明，種子萌發(fā)過程中產(chǎn)生的代謝熱可以描述種子的新陳代謝水平，而新陳代謝水平的高低正是反映種子活力高低的重要指標[33]。因此，種子溫度的變化必然與種子的活力有著密切的聯(lián)系，對種子溫度信息的捕捉可以用來推測種子的活力水平。Kranner等首先提出將紅外熱成像技術應用于種子活力檢測，用紅外熱成像儀捕捉5種老化程度不同的豌豆種子在吸水萌發(fā)過程中的溫度變化，證實了紅外熱成像技術在種子活力檢測中的可行性[33]。

Fang等基于稻種老化時間不同時的物理學和生理學差異，提出一種基于紅外熱成像技術無損檢測稻種發(fā)芽率的方法，建立了稻種發(fā)芽率的紅外熱模型，結果表明，所建模型在稻種發(fā)芽率無損檢測方面有較高的精度（相關系數(shù)和標準偏差分別為0.900 3和4.101 2）[34]，證實采用紅外熱成像技術檢測稻種發(fā)芽率是可行的。

2.7?其他技術

由于無損、快速測定種子發(fā)芽率的現(xiàn)實需要，除了上述技術外，研究人員紛紛致力于對其他技術的開發(fā)，目前已報道的有分色法、激光散斑技術（laser speckle）和超微弱發(fā)光（ultraweak luminescence）等。

分色法根據(jù)種皮顏色預測種子發(fā)芽率。吳國平等根據(jù)比色卡將三葉芹種子按顏色分組，再將分組種子的百分比數(shù)分別與相應顏色的發(fā)芽率統(tǒng)計數(shù)據(jù)相乘之后求和，結果作為待測定三葉芹種子發(fā)芽率的預測值，經(jīng)過和標準試驗結果對比發(fā)現(xiàn)，分色法預測出的發(fā)芽率與實際發(fā)芽率之間無顯著差異，可用作種子質(zhì)量檢驗[35]。

激光散斑是指當激光照射在相對粗糙物體表面上時形成的隨機干涉圖樣，散斑特征可以反映種子內(nèi)部粒子的活躍程度，指示種子的活力大小。李黔渝等通過激光散斑成像技術，利用栓皮櫟種子內(nèi)部散射粒子的動態(tài)變化與激光散斑變化的對應關系，通過圖像處理技術分辨種子內(nèi)部粒子的活躍程度，結果發(fā)現(xiàn)，其與種子發(fā)芽情況及種子活力具有較高的一致性，認為可以利用激光散斑技術對種子發(fā)芽情況進行快速測定[36]。

超微弱發(fā)光是一種低水平的生物發(fā)光，反映了生物體細胞內(nèi)和細胞間的新陳代謝、功能調(diào)解和信息交換，是生物體生長代謝的動態(tài)指標[37]。研究表明，經(jīng)過電磁輻射處理的大豆生活力比未處理的種子大大增強，而同時其超微弱發(fā)光值也顯著增加;而當采用代謝抑制劑處理綠豆種子后，種子活性大大降低，其超微弱發(fā)光值也同時降低[38]。王春芳等對貯藏 0～24 個月的稻谷和小麥種子進行了超弱發(fā)光分析，結果發(fā)現(xiàn)，貯藏期間稻谷的超弱發(fā)光值與其發(fā)芽率之間呈良好的非線性關系，而小麥的超弱發(fā)光值與其發(fā)芽率之間呈良好的線性關系，所獲模型可以很好地通過稻谷和小麥的超弱發(fā)光值來預測其發(fā)芽率[39]。

3?結論與展望

光譜學、高光譜成像和質(zhì)譜法通過檢測某種化學成分的光譜和質(zhì)譜信息，間接計算出該化學成分在種子中的含量，進而探討該成分與發(fā)芽率之間的相關性。軟X射線法通過射線的穿透性，呈現(xiàn)種子內(nèi)部完整結構，通過內(nèi)部結構分析，尋找其與發(fā)芽率之間的關系。

電子鼻和熱成像技術分別檢測種子的揮發(fā)氣味和表面熱分布，探討其與種子發(fā)芽率之間的關聯(lián)。分色法、激光散斑技術和超微弱發(fā)光方法分別嘗試從種子顏色、散斑特征和生物發(fā)光角度，建立檢測結果與發(fā)芽率之間的關聯(lián)，實現(xiàn)對發(fā)芽率的間接測定。

綜上可知，上述發(fā)芽率無損檢測方法通過分析種子的物理（光譜、質(zhì)譜、熱成像、X光圖像、種皮顏色及散斑）和化學（揮發(fā)氣味）特征，探討這些特征與發(fā)芽率之間的相關性，因此都是間接測定法。

由于種子發(fā)芽是一個動態(tài)過程，牽涉到諸多內(nèi)部生理變化，而上述方法均從單一角度和指標進行發(fā)芽率檢測，結果的精確性和準確性很難保證。因此歸納發(fā)芽率無損檢測目前存在的問題。（1）間接性。以上發(fā)芽率無損檢測方法通過分析種子的物理、化學特征，探討該特征與發(fā)芽率之間的相關性，間接得出該特征與發(fā)芽率之間的相關關系。間接性帶來了無損、快速等優(yōu)點，但準確性卻難以保證。（2）單一性。上述方法針對單一理化特征進行測定，而這一特征與發(fā)芽率之間只是存在一定相關性，造成結果的預測成分大于實際成分，因此，這些方法更準確地講是發(fā)芽率預測方法而不是檢測方法。（3）波動性。以上方法大多選定一個作物品種作試驗材料，沒有考慮該方法對不同品種、不同收獲條件和貯藏時間種子進行檢測時結果的波動性，方法的適用性、穩(wěn)定性與可靠性還有待進一步研究。

基于以上分析認為，種子發(fā)芽率無損檢測今后可以從以下方面開展。

（1）加強理論研究。重點研究種子萌發(fā)過程中內(nèi)部生理生化指標變化，明確種子發(fā)芽率與種子活力及生活力的內(nèi)在區(qū)別，基于有發(fā)芽能力和無發(fā)芽能力種子的生理差異，研發(fā)更具針對性的種子發(fā)芽率無損檢測技術。（2）綜合使用現(xiàn)有無損檢測方法。針對具體作物篩選出2～3種有效方法同時使用，方法之間相互印證或彌補不足，使用多個測定結果綜合預測具體發(fā)芽率數(shù)值，提高預測準確度。（3）加大樣本種類和數(shù)量。加強數(shù)據(jù)收集，針對大量品種，盡可能多地收集不同收獲條件、不同貯藏狀況種子樣本，建立更具普適性的發(fā)芽率無損檢測技術，從總體上明確該技術的適用范圍及準確度。

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