孫昭，李哲，谷俊杰，楊瑩，白春梅，管梅

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，北京 100730

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，目前，中國每年新發(fā)病例數(shù)約37萬，其起病隱匿，中國人群的內(nèi)鏡檢查率相對較低，導(dǎo)致25%的患者明確診斷時已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且約50%可切除的結(jié)直腸癌患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，因此，結(jié)直腸癌每年死亡病例數(shù)約20萬。腫瘤微環(huán)境中的非腫瘤細(xì)胞對腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后均具有重要影響，其中，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblast，CAF）在腫瘤微環(huán)境中起重要作用，其主要特征為表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）。CAF高表達(dá)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4、IL-6、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、TGF-β、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和趨化因子受體2（C-C motif chemokine receptor 2，CCR2）等炎性因子，可募集多種免疫抑制細(xì)胞，形成腫瘤免疫抑制微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸；也可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。α-SMA的高表達(dá)與乳腺癌、肺癌和口腔癌患者的預(yù)后不良均有關(guān)[1-3]。結(jié)直腸癌組織中也存在大量的CAF，可能與結(jié)直腸癌的進(jìn)展有關(guān)，因此，本研究探討α-SMA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況及其與結(jié)直腸癌患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年11月至2015年12月于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院接受手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者。所有患者均經(jīng)病理證實為結(jié)直腸癌，且均有詳細(xì)的臨床資料，均行R0切除術(shù)；術(shù)后均采用氟尿嘧啶聯(lián)合奧沙利鉑的化療方案進(jìn)行輔助治療；有完整的影像學(xué)資料供腫瘤分期評價；有足夠的組織標(biāo)本供免疫組織化學(xué)檢測。本研究共納入103例結(jié)直腸癌患者。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）頒布的腫瘤TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行分期：Ⅱ期66例，Ⅲ期37例；男49例，女54例；＞60歲76例，≤60歲27例；腫瘤部位：左半結(jié)直腸癌25例，右半結(jié)直腸癌78例；病理類型：高分化腺癌22例，中分化腺癌70例，低分化腺癌5例，黏液細(xì)胞癌5例，印戒細(xì)胞癌1例；微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）患者 27例，微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stability，MSS）患者67例，無微衛(wèi)星穩(wěn)定情況數(shù)據(jù)患者9例。收集103例結(jié)直腸癌患者經(jīng)手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本。

1.2 免疫組化染色法檢測結(jié)直腸癌組織中α-SMA的表達(dá)

采用10%的甲醛溶液固定結(jié)直腸癌組織，常規(guī)進(jìn)行結(jié)直腸癌組織的取材、脫水和石蠟包埋，制作厚度為4 μm的石蠟包埋組織塊。石蠟切片均常規(guī)脫蠟至水，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液進(jìn)行微波抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，山羊血清封閉15 min；加入鼠抗人α-SMA抗體（1∶200稀釋，購自武漢塞維爾生物科技有限公司），4℃冰箱過夜；滴加山羊抗鼠通用抗體（購自丹麥DAKO公司），室溫孵育2 h，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作為陰性對照，以血管平滑肌作為陽性對照；然后切片常規(guī)脫水至二甲苯，樹脂封片，在顯微鏡下觀察。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

所有石蠟切片的免疫組化檢測結(jié)果由2名病理科醫(yī)師采用雙盲方法獨立判讀。α-SMA主要表達(dá)于結(jié)直腸癌中CAF的細(xì)胞漿中，陽性染色呈棕色顆粒。隨機選擇5個高倍視野，根據(jù)染色強度與陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評分。染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)：無色為0分，淡棕色為1分，深棕色為2分；陽性細(xì)胞所占百分比評分標(biāo)準(zhǔn)：在5個高倍視野下計算染色細(xì)胞占視野細(xì)胞總數(shù)的百分比，陽性細(xì)胞＜10%為0分，10%～39%為1分，40%～69%為2分，≥70%為3分。染色強度評分與陽性細(xì)胞所占百分比評分相加，總分0～2分為α-SMA低表達(dá)，3～5分為α-SMA高表達(dá)。

1.4 隨訪

隨訪截止到患者進(jìn)展，隨訪方式為門診隨訪和電話隨訪，無進(jìn)展結(jié)直腸癌患者的末次隨訪日期為2018年1月。無病生存期指從手術(shù)后R0切除開始至有影像學(xué)資料證明疾病復(fù)發(fā)的時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存分析采用Log-rank檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中α-SMA 蛋白的表達(dá)情況

103例結(jié)直腸癌患者中有25例患者α-SMA高表達(dá)，78例患者α-SMA低表達(dá)。不同性別、年齡、腫瘤部位、病理類型、TNM分期、微衛(wèi)星穩(wěn)定性情況結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中α-SMA的表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（圖1、表1）

圖1 α-SMA 在結(jié)直腸癌組織CAF 中的表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）

表1 不同臨床特征結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中α-SMA蛋白的表達(dá)情況（n=103）

2.2 α-SMA 蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者無病生存情況的關(guān)系

截至隨訪結(jié)束，78例α-SMA低表達(dá)患者中有25例患者進(jìn)展，3年累積無病生存率為74.4%；25例α-SMA高表達(dá)的患者中有12例患者進(jìn)展，3年累積無病生存率為52.0%。α-SMA低表達(dá)結(jié)直腸癌患者的無病生存結(jié)局優(yōu)于α-SMA高表達(dá)的患者（χ2=4.513，P＜0.05）（圖2）。

截至隨訪結(jié)束，亞組分析結(jié)果顯示，TNM分期為Ⅱ期的結(jié)直腸癌患者中，α-SMA高表達(dá)患者的3年累積無病生存率為74.1%，α-SMA低表達(dá)患者的3年累積無病生存率為75.0%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。TNM分期為Ⅲ期的結(jié)直腸癌患者中，α-SMA高表達(dá)患者的3年累積無病生存率為30.8%，低于α-SMA低表達(dá)患者的75.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.714，P＜0.05）（圖4）。

圖2 α-SMA高表達(dá)（n=78）和低表達(dá)（n=25）結(jié)直腸癌患者的無病生存曲線

圖3 α-SMA高表達(dá)Ⅱ期（n=12）和低表達(dá)Ⅱ期（n=54）結(jié)直腸癌患者的無病生存曲線

圖4 α-SMA高表達(dá)Ⅲ期（n=13）和低表達(dá)Ⅲ期（n=24）結(jié)直腸癌患者的無病生存曲線

3 討論

腫瘤組織中CAF的來源并不十分清楚，可能來源于腫瘤周圍正常組織中固有的成纖維細(xì)胞，也可能來源于循環(huán)組織或周圍組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞[5-6]。結(jié)直腸癌組織中存在大量的CAF，CAF可分泌大量的生長因子，如上皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子和VEGF等，從而激活促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷酸肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，提供結(jié)直腸癌細(xì)胞生長代謝所需要的物質(zhì)，誘導(dǎo)腫瘤血管生成和抑制性免疫細(xì)胞歸巢，形成有利于腫瘤生長的微環(huán)境，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等[7-12]。因此，CAF與結(jié)直腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，可能成為結(jié)直腸癌治療的新靶點。

α-SMA高表達(dá)是CAF的主要特征之一，與實體瘤患者的預(yù)后不良有關(guān)[13]。Tsujino等[14]研究發(fā)現(xiàn)，α-SMA高表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立危險因素。Valcz等[15]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中E-鈣黏蛋白與α-SMA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[15]，E-鈣黏蛋白是上皮細(xì)胞的重要標(biāo)志物，其表達(dá)下調(diào)可能是CAF促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞從上皮樣細(xì)胞向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的結(jié)果。腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素，因此，CAF可能通過促進(jìn)腫瘤上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Ikuta等[16]研究發(fā)現(xiàn)，α-SMA高表達(dá)、膠原沉積是Ⅲ期結(jié)直腸癌患者預(yù)后較差的分子生物學(xué)標(biāo)志。上述研究結(jié)果均與本研究結(jié)果存在類似之處。本研究結(jié)果顯示，在手術(shù)可切除的結(jié)直腸癌患者中，α-SMA低表達(dá)結(jié)直腸癌患者的無病生存結(jié)局優(yōu)于α-SMA高表達(dá)的患者（P＜0.05），且α-SMA高表達(dá)Ⅲ期結(jié)直腸癌患者的3年累積無病生存率低于α-SMA低表達(dá)的Ⅲ期結(jié)直腸癌患者。α-SMA的表達(dá)水平與Ⅱ期結(jié)直腸癌患者的無病生存情況無關(guān)，這可能是因為Ⅱ期結(jié)直腸癌患者的預(yù)后本來就好的緣故。另外，結(jié)直腸癌組織中α-SMA的表達(dá)水平與患者的性別、年齡、腫瘤部位、病理類型、TNM分期和微衛(wèi)星穩(wěn)定性情況均可能無關(guān)，從而證明CAF的存在在不同結(jié)直腸癌患者群體中可能無明顯差異。但是，α-SMA在Ⅲ期結(jié)直腸癌患者中的高表達(dá)率為35.1%，高于Ⅱ期結(jié)直腸癌患者的18.2%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），分析其原因可能與本研究納入的病例數(shù)較少有關(guān)。CAF在惡性腫瘤組織中普遍存在，除了α-SMA是CAF的標(biāo)志物外，成纖維細(xì)胞活化蛋白和波形蛋白等也是CAF的標(biāo)志物。本研究僅選擇了α-SMA作為CAF的標(biāo)志物，可能不足以代表全部的CAF群體。另外本研究僅僅說明了在結(jié)直腸癌組織中CAF較多的患者的預(yù)后更差，但是對CAF促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展的機制并未揭示，且CAF和結(jié)直腸癌細(xì)胞之間的相互作用仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，α-SMA低表達(dá)結(jié)直腸癌患者的無病生存結(jié)局優(yōu)于α-SMA高表達(dá)的患者，且不同α-SMA表達(dá)情況的Ⅲ期結(jié)直腸癌患者無病生存結(jié)局的差異更為顯著，而不同α-SMA表達(dá)情況的Ⅱ期結(jié)直腸癌患者的無病生存結(jié)局無差異。α-SMA可能作為結(jié)直腸癌治療選擇和預(yù)后預(yù)測的分子生物學(xué)標(biāo)志物，而CAF有可能成為結(jié)直腸癌治療的新靶點。