焦思萌，趙軒宇，宋丹，陳嬌，商若天，張強(qiáng)，劉思迪，孔為民#，韓東

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院1產(chǎn)一科，2婦瘤科，北京 100006

3國(guó)家納米科學(xué)中心，北京100190

子宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率位居首位[1]。中國(guó)每年新發(fā)病例約13.15萬(wàn)例，每年死于宮頸癌的患者約5萬(wàn)例[2]。在中晚期宮頸癌的治療中順鉑是單藥化療最有效的藥物[3]，但因患者的個(gè)體差異和化療耐藥的問(wèn)題，宮頸癌患者化療療效存在很大差異。目前有關(guān)宮頸癌化療敏感性及化療耐藥的相關(guān)研究多集中于宮頸癌細(xì)胞內(nèi)在因素的影響，如相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)，相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。宮頸癌細(xì)胞并不是孤立生長(zhǎng)的，其所生存的細(xì)胞微環(huán)境可能在其發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4]。腫瘤微環(huán)境中的參數(shù)包括剛度、形貌、曲率及剪應(yīng)力等?；讋偠仁悄[瘤微環(huán)境中的一個(gè)重要的力學(xué)參數(shù)，剛度是指細(xì)胞或組織在載荷作用下抵抗彈性形變的能力。本研究從細(xì)胞微環(huán)境中的力學(xué)因素出發(fā)，探討改變基底剛度是否會(huì)影響宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，是否影響順鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源及實(shí)驗(yàn)試劑 人宮頸癌HeLa細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)；順鉑粉劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo公司。

1.1.2 不同基底剛度培養(yǎng)皿的選擇 水凝膠培養(yǎng)基模擬不同組織的剛度。選擇0.5、5、25kPa分別模擬淋巴結(jié)、肺組織及宮頸脫落細(xì)胞的剛度；并以普通塑料培養(yǎng)皿作為對(duì)照，其剛度約為106kPa[5]。可控剛度的水凝膠培養(yǎng)皿購(gòu)自北京德潤(rùn)豐科技有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HeLa 細(xì)胞的培養(yǎng) 將HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，以每孔2×l04個(gè)細(xì)胞分別接種于基底剛度為0.5、5、25 kPa水凝膠培養(yǎng)皿及普通塑料24孔板（106kPa）中培養(yǎng)。分別于接種后第4～96小時(shí)，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定細(xì)胞活性。每個(gè)剛度每個(gè)時(shí)間點(diǎn)條件下設(shè)立5個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.2.3 順鉑藥敏實(shí)驗(yàn) 在不同基底剛度分組的基礎(chǔ)上，按照不同給藥濃度分為順鉑加藥組，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組（含細(xì)胞和培養(yǎng)基，不加藥物，即藥物濃度為0 μmol/L）及空白對(duì)照組（不含細(xì)胞只含培養(yǎng)基），每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。順鉑藥物濃度梯度根據(jù)藥物血峰值濃度（peak plasma concentration，PPC）設(shè)計(jì)，順鉑藥物PPC為12.6 μmol/L[6]，故設(shè)順鉑藥物濃度梯度為0、5、10、20、40 μmol/L。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，以每孔2×l04個(gè)細(xì)胞的密度分別接種于基底剛度為0.5、5、25 kPa水凝膠培養(yǎng)皿及普通塑料24孔板（106kPa）中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h后，順鉑加藥組每孔加入不同濃度的順鉑，終濃度分別為0、5、10、20、40 μmol/L，共同培養(yǎng)24 h后采用CCK-8法行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。計(jì)算細(xì)胞存活率，存活率=（[順鉑加藥組平均吸光度值（optical density，OD）-空白對(duì)照組平均OD值）（/陰性對(duì)照組平均OD值-空白對(duì)照組平均OD值）]×100%，計(jì)算不同濃度順鉑作用下HeLa細(xì)胞的存活率，并制作細(xì)胞毒性曲線(xiàn)，計(jì)算出半數(shù)抑制濃度（IC50）值。計(jì)算IC50公式：lgIC50=Xm-I[P-（3-Pm-Pn）/4]，Xm 為lg 最大劑量，I為 lg最大劑量/相鄰劑量，P為陽(yáng)性反應(yīng)率之和，Pm為最大陽(yáng)性反應(yīng)率，Pn為最小陽(yáng)性反應(yīng)率[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

HeLa細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)及其順鉑藥物敏感性實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)應(yīng)用Graphpad Prism軟件繪制細(xì)胞存活曲線(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 基底剛度對(duì)HeLa宮頸癌細(xì)胞增殖活性的影響

將相同數(shù)量的HeLa細(xì)胞接種于不同基底剛度的24孔板中，從接種當(dāng)天第4小時(shí)開(kāi)始，連續(xù)4天（96 h）應(yīng)用CCK8法測(cè)定細(xì)胞密度。并根據(jù)4～96 h每組細(xì)胞的OD值繪制增殖曲線(xiàn)。培養(yǎng)后24、48、72、96 h，隨基底剛度的增加OD值（細(xì)胞增殖活性）呈上升趨勢(shì)。（圖1）

圖1 不同基底剛度培養(yǎng)皿中HeLa 細(xì)胞增殖曲線(xiàn)

2.2 基底剛度對(duì)HeLa 宮頸癌細(xì)胞順鉑藥物毒性的影響

在同一基底剛度下，HeLa細(xì)胞存活率隨順鉑濃度增加而降低。而在相同順鉑濃度下，隨基底剛度的增加HeLa細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)（圖2）。根據(jù)公式計(jì)算出各組IC50值，0.5、5、25 kPa水凝膠培養(yǎng)皿及普通塑料培養(yǎng)皿中HeLa細(xì)胞順鉑IC50值分別為137.20、97.62、52.87、18.40 μmol/L。

圖2 不同基底剛度下不同濃度順鉑處理后HeLa細(xì)胞的存活率

3 討論

宮頸癌是世界范圍內(nèi)第二大常見(jiàn)女性惡性腫瘤，在女性與腫瘤相關(guān)的死因中，宮頸癌位居第2位。為了提高患者的生存率，婦科腫瘤醫(yī)師不斷摸索不同的綜合治療模式，1983年首次報(bào)道宮頸癌是化療敏感的腫瘤，目前應(yīng)用最廣泛的藥物有順鉑或卡鉑、紫杉醇、異環(huán)磷酰胺和博來(lái)霉素等。對(duì)于中晚期及復(fù)發(fā)性宮頸癌患者，順鉑仍是最有效的姑息性化療藥物[8]。但因患者的個(gè)體差異和化療耐藥的問(wèn)題，宮頸癌患者在同步放化療后的療效存在很大差異，30%～40%的患者在接受標(biāo)準(zhǔn)治療后的兩年內(nèi)發(fā)生了局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[9]。因此，關(guān)于中晚期宮頸癌同步放化療如何提高化療敏感性的問(wèn)題需要進(jìn)一步系統(tǒng)的研究。

腫瘤微環(huán)境中納米力學(xué)相關(guān)的參數(shù)包括剛度、形貌、曲率以及剪應(yīng)力等，它們對(duì)細(xì)胞的行為有重要的影響。其中基底剛度是腫瘤微環(huán)境中一個(gè)重要的力學(xué)參數(shù)，剛度是指細(xì)胞或組織在載荷作用下抵抗彈性變形的能力?；讋偠茸鳛槟[瘤微環(huán)境中一個(gè)很重要的生物力因素，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、活性、分化和遷移等生物學(xué)過(guò)程[5-6,10]。細(xì)胞為適應(yīng)其周?chē)h(huán)境力學(xué)性質(zhì)的改變，其自身黏附能力、遷移能力以及骨架狀態(tài)等都會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，從而使自身的力學(xué)性質(zhì)也發(fā)生改變[11-12]。此前，有關(guān)基底剛度對(duì)宮頸癌的相關(guān)研究較少，故設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)研究。

3.1 基底剛度對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖活性的影響

有研究顯示，基底的力學(xué)性能可影響細(xì)胞的增殖活性，但并非所有細(xì)胞均對(duì)基底剛度的改變產(chǎn)生響應(yīng)[13]。多數(shù)細(xì)胞傾向于在剛度較大的基底上鋪展面積更大、黏附更好、增殖活性更強(qiáng)；而在較低剛度的基底上鋪展、黏附及增殖情況均較差，甚至不能存活[14]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，少數(shù)細(xì)胞如神經(jīng)元細(xì)胞，在基底剛度較小的培養(yǎng)材料上生長(zhǎng)情況更好；另有如中性粒細(xì)胞等，其生長(zhǎng)狀態(tài)及增殖情況受基底剛度改變影響不大，其在3～50 kPa剛度范圍的基底上均能存活[15]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，隨基底剛度的增大，人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖活性更強(qiáng)。

3.2 基底剛度對(duì)宮頸癌HeLa 細(xì)胞順鉑藥物毒性的影響

基于前述基底剛度對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的研究，進(jìn)一步探討了在不同基底剛度培養(yǎng)皿中HeLa細(xì)胞對(duì)順鉑藥物敏感性的差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同順鉑濃度下，HeLa細(xì)胞存活率隨基底剛度的增加呈下降趨勢(shì)，即增加基底剛度可提高HeLa細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。Feng等[16]有關(guān)乳腺癌MCF細(xì)胞的體外研究顯示，在剛度較大的基底上乳腺癌MCF細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑及紫杉醇的藥物毒性反應(yīng)均有不同程度的增加。Schrader等[17]在基底剛度對(duì)肝癌細(xì)胞化療敏感性的研究中亦發(fā)現(xiàn)，與較小的基底剛度相比，在剛度較大的基底上肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的毒性反應(yīng)更明顯。另有相關(guān)研究顯示，與較小剛度的水凝膠相比，在剛度較大的玻璃基底上，順鉑對(duì)肺成纖維細(xì)胞的效果更明顯[18]。Liu等[19]研究結(jié)果顯示，基底剛度的改變亦可影響乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞對(duì)靶向藥物拉帕替尼藥物毒性的響應(yīng)，即在剛度較大的基底上SK-BR-3細(xì)胞對(duì)拉帕替尼的藥效更明顯。以上研究結(jié)果均提示，腫瘤微環(huán)境中力學(xué)因素——?jiǎng)偠鹊母淖兛赡芤鹉[瘤細(xì)胞對(duì)藥物反應(yīng)的差異。

2002年首次提出了“生物力藥理學(xué)”的概念[20]。生物力藥理學(xué)主要考慮藥物與體內(nèi)生物力學(xué)因素的聯(lián)合作用：一方面藥物具有藥效，同時(shí)也可能調(diào)整體內(nèi)的生物力學(xué)環(huán)境；另一方面，生物力學(xué)因素可能具有生物學(xué)功效，也可能影響藥物代謝與藥效。生物力藥理學(xué)是研究藥理學(xué)因素（藥物）對(duì)體內(nèi)生物力學(xué)因素的干預(yù)，也研究生物力學(xué)因素對(duì)藥效與藥物代謝的影響，以及藥物與力學(xué)因素的聯(lián)合生物學(xué)效應(yīng)。以往的相關(guān)研究以及本研究結(jié)果均顯示了基底剛度影響腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的反應(yīng)，這提示腫瘤的藥物治療中需考慮生物力學(xué)因素與藥效、藥理的密切關(guān)系?；谏鲜龌讋偠瓤捎绊懩[瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物反應(yīng)的觀點(diǎn)，在體外藥物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也應(yīng)該考慮到剛度這一關(guān)鍵的生物力學(xué)因素，以達(dá)到更好的藥物實(shí)驗(yàn)效果。本研究結(jié)果也證明了生物力藥理學(xué)的合理性。

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)基底剛度的改變不但影響著宮頸癌細(xì)胞HeLa的生長(zhǎng)，也影響著其對(duì)化療藥物的敏感性。因此在宮頸癌的臨床治療中，應(yīng)考慮到基底剛度改變對(duì)腫瘤生長(zhǎng)與治療的影響。今后將進(jìn)一步研究基底剛度改變對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)、化療敏感性影響的分子生物學(xué)機(jī)制，如尋找剛度相關(guān)基因、力學(xué)相關(guān)分子靶點(diǎn)、剛度相關(guān)信號(hào)通路等；并尋找能夠改變腫瘤細(xì)胞外力學(xué)環(huán)境的有效方法，如應(yīng)用藥物、基因治療等，進(jìn)而從微環(huán)境中的力學(xué)因素角度出發(fā)，尋找提高宮頸癌化療敏感性的有效方法，提高宮頸癌的臨床治療效果。