梁 昊，顧一心，周貴蘭，張建中，張茂俊

食源性彎曲菌感染被認為是發(fā)展中國家和發(fā)達國家細菌性腹瀉的主要原因，是重要的公共衛(wèi)生問題[1-3]。最近的研究顯示，在北京的腹瀉病例中，彎曲菌的分離率在主要細菌病原體中排名第3[3]。在食源性彎曲菌的感染中，空腸彎曲菌占主導(dǎo)地位，其感染也與罕見的感染后癥狀有關(guān)，如反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barré syndrome, GBS)等，在少數(shù)情況下，空腸彎曲菌感染可導(dǎo)致患者死亡。空腸彎曲菌可在從哺乳動物到鳥類的多種動物宿主中發(fā)現(xiàn)[4-5]，包括牛、豬、羊等家畜動物，雞、鴨等家禽動物以及烏鴉、鴿子等鳥類?？漳c彎曲菌大量存在于這些自然宿主中，尤其是家禽中[6]。由于糞-口感染途徑的“高效”，一旦彎曲菌感染到養(yǎng)殖場的家禽中，幾天內(nèi)感染即可蔓延到整個群體[7]。在屠宰過程中，動物胴體也可能會受到空腸彎曲菌污染，導(dǎo)致家禽產(chǎn)品在零售過程中的污染，這些被污染的家禽產(chǎn)品通常被認為是造成人群空腸彎曲菌感染的主要原因[8]。

空腸彎曲菌發(fā)病機制尚不完全清楚，已鑒定出的毒力因子包括鞭毛蛋白(flaA)、黏附相關(guān)蛋白(cadF)、脂蛋白(ceuE)、細胞毒素(cdtB)和脂寡糖唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因(cstII、cstIII)等[9-10]。過去的研究表明，VI型分泌系統(tǒng)(Type VI secretion system, T6SS)在霍亂弧菌、銅綠假單胞菌和嗜水氣單胞菌等病原體的毒力中發(fā)揮重要作用[11-13]。這些細菌可以在許多生態(tài)位中定居，包括土壤、海洋環(huán)境、植物、無脊椎動物、脊椎動物和哺乳動物，這意味著T6SS可能在這些不同的生態(tài)位中發(fā)揮作用，在1/4以上的變形桿菌中發(fā)現(xiàn)了T6SS基因簇[14]。這些T6SS基因簇通常在不同物種之間具有不同的組成，但通常包含至少13個編碼注射裝置基本元素的核心基因[15]。全基因組測序顯示，在空腸彎曲菌中，完整的T6SS基因簇的存在與hcp(溶血素協(xié)同蛋白)基因的存在密切相關(guān)[16]?？漳c彎曲菌T6SS在毒力方面具有多種作用，包括細胞粘附、對紅細胞的細胞毒性和小鼠定植[17]。

然而，T6SS基因簇在中國空腸彎曲菌的分布和結(jié)構(gòu)特征尚不清楚。本研究旨在通過全基因組分析來對其加以明確。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1測序菌株 本實驗室中保存的35株空腸彎曲菌，其中12株從雞分離，23株從病人(包括腹瀉病人和GBS病人)分離。同時從NCBI數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.org/)中下載了雞、鳥類、牛、羊等不同來源的17株國外菌株(表1)。

表1 菌株基本情況

Tab.1 Summary of isolates

菌株名稱來源分離地區(qū)Accession Number?BJ-CJD-101腹瀉病人北京ARWV00000000BJ-CJD120腹瀉病人北京LISM00000000BJ-CJD39腹瀉病人北京LISI00000000BJ-CJD55腹瀉病人北京LISJ00000000BJ-CJD63腹瀉病人北京LISK00000000BJ-CJD70腹瀉病人北京LISL00000000BJ-CJGB-96G25GBS病人北京ASXL00000000BJ-CJGB95377GBS病人北京ASXK00000000BJ-CJGB96114GBS病人北京ASXM00000000BJ-CJGB96299GBS病人北京ASXN00000000BJ-CJH18雞北京LISN00000000BJ-CJH23雞北京LISO00000000BJCJH13雞北京BJCJH15雞北京HB-CJGB-LCGBS病人河北ASXO00000000HB-CJGB-LLGBS病人河北ATBJ00000000HB-CJGB-LXCGBS病人河北ATBL00000000HB-CJGB-QYTGBS病人河北ATBM00000000HB-CJGB-XWMGBS病人河北ATBN00000000HB-CJGB-ZBGBS病人河北ATBR00000000HB-CJGB-ZHXGBS病人河北ATBS00000000HB-CJGB-ZXGBS病人河北ATBT00000000HBCJH3雞河北HBCJH5雞河北HN-CJD07035腹瀉病人河南ARYE00000000ICDCCJ07001GBS病人吉林CP002029ICDCCJ07002腹瀉病人吉林APNP00000000ICDCCJ07004腹瀉病人吉林APNQ00000000JL-CJHLIU1-1雞吉林LISQ00000000SH-CJD11C664腹瀉病人上海LISP00000000ZJCJHD11雞浙江ZJCJHD13雞浙江ZJCJHD7雞浙江ZJCJHE2雞浙江ZJCJHE7雞浙江CJJ5070雞芬蘭CCXG00000000ATCC-35925鳥類瑞典CP020045P10-2209鳥類日本JYEC01000000P5-2209鳥類日本JYEB01000000MTVDSCj20雞美國CP008787.1F15M00601牛美國MOUO00000000F15M00603F23牛美國MOUM00000000M00214牛美國MOVP00000000F15M01909羊美國MOTW00000000F15M01918羊美國MOTV00000000OD267雞美國CP014744RM1285雞美國CP012696WP2202雞美國CP014742YH001牛美國CP010058YH002牛美國CP020776RM1221雞美國CP000025ZP3204雞美國CP017856

*空白部分菌株尚未獲得GenBank號

1.1.2主要試劑 菌株培養(yǎng)：Karmali CAMPYLOBACTER AGAR BASE(OXOID，英國)，脫纖維羊血(藍博睿生物，北京)；菌株鑒定用試劑：2×EasyTaqPCR Super mix(全式金生物技術(shù)公司，中國)，Trans 2K DNA Marker(全式金生物技術(shù)公司，中國)，Regμlar Agarose G-10瓊脂糖(BIOWEST公司，法國)，Gel-Red染料(BIOTIUM公司,美國)；DNA提?。篧izard Genomic DNA試劑盒(Promega，美國)

1.2 方 法

1.2.1菌株培養(yǎng)和DNA提取 將保存在-80 ℃的菌株復(fù)蘇在含有5%脫纖維羊血的Karmali培養(yǎng)基上，置于37 ℃三氣培養(yǎng)箱(5% O2、10% CO2、85% N2)中培養(yǎng)48 h，為保證菌株純度，所有菌株均進行三代單克隆傳代培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的菌株使用Wizard Genomic DNA試劑盒按說明書進行菌株的DNA的提取。

1.2.2菌株基因組測序 將菌株DNA使用ND-1000分光光度計(Nanodrop，美國)進行濃度和純度測定，合格樣品濃度≥50 ng/μL和總量>20 μg，OD260/OD280值在1.6～1.8之間，并且瓊脂糖凝膠電泳檢查，顯示一條清晰的核酸帶。將提取的DNA樣本送至武漢華大基因科技有限公司做高通量測序，通過Hiseq 2000測序平臺進行pair-end雙端測序。測序數(shù)據(jù)處理使用軟件fastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)去掉低質(zhì)量reads，然后使用SOAPdenovo v2.04 (http://soap.genomics.org.cn/soapdenovo.html)軟件對高質(zhì)量reads組裝成scaffolds，并用SOAPaligner將reads和scaffolds比對，進行單堿基校正。

1.2.3系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建 采用最大似然法(maximum likelihood, ML) 基于核心基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。首先，基于全基因組SNPs分析的結(jié)果，去掉全基因組中非核心基因和間隔區(qū)的SNPs，然后通過Gubinns[18]軟件去重組，最終得到高質(zhì)量SNPs，將這些SNPs位點接在一起形成一條SNPs序列。系統(tǒng)發(fā)育樹通過FastTree v2.1.10[19]軟件的GTR模型構(gòu)建，進行1 000次bootstraps校驗。

1.2.4T6SS基因簇結(jié)構(gòu)分析 結(jié)合過去研究[15]，在毒力因子數(shù)據(jù)庫(Virulence Factor Database, VFBD)[20]中獲得T6SS相關(guān)的基因序列組成本地數(shù)據(jù)庫，并將本研究中獲得菌株序列通過Blast軟件[21]進行搜索，分析各菌株中是否含有T6SS基因簇，以及其結(jié)構(gòu)特征。同時，將獲得的T6SS基因簇與與雞螺桿菌和簡明彎曲菌的T6SS基因簇(Accession Number: JXTW00000000和CP000792)進行比較，使用GSDS v2.0軟件[22]展示分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1基因組測序及組裝 本研究所涉及的菌株除過去已經(jīng)發(fā)表外，拼接組裝后空腸彎曲菌的Scaffold數(shù)量在9～76個之間，平均長度在23～110 kb，最大長度為172～572 kb，基因組整體長度在1.5～1.9 Mb之間，GC含量30.05%～30.48%，長度和GC含量均符合空腸彎曲菌基因組特征。

2.2基因組序列系統(tǒng)發(fā)育分析 將基因組上經(jīng)過去重組后所有SNP位點根據(jù)位置按不同菌株內(nèi)堿基狀態(tài)連成一條序列，使用FastTree(bootstrap 1000)軟件對52株空腸彎曲菌使用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過去重組的步驟，可將重組引入的SNP去掉，剩下的位點則是菌株豎向遺傳的信號，通過這些位點能夠得到菌株間進化關(guān)系，由此可獲得空腸彎曲菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(如圖1)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹中各菌株遺傳距離， 52株空腸彎曲菌被分為6個種群分支(Clade 1～6)，分別對應(yīng)了不同來源的菌株，依次為鳥類來源分支、雞來源分支1、牛來源分支、臨床病人分離菌株分支、混合來源分支和雞來源分支2。其中，除Clade 4外，其他clade中也彌散分布著臨床病人分離菌株。在混合來源分支中，包含了雞、羊、牛和臨床病人分離菌株等多種來源的菌株。

2.3空腸彎曲菌T6SS基因簇結(jié)構(gòu)特征 通過比對長度大約為14 kb的空腸彎曲菌T6SS基因簇序列，發(fā)現(xiàn)14個基因，其中impH/vasB、impG/vasA、impC、impB、vasD/lip、impJ/vasE、impK/ompA/vasF/dotU、impL/vasK/icmF、hcp等9種基因為目前已經(jīng)確認的主要功能基因[23]。同時與與雞螺桿菌和簡明彎曲菌的T6SS基因簇序列進行比較，發(fā)現(xiàn)空腸彎曲菌T6SS基因簇與其具有某些相同的基因，但是基因的排列有顯著差異(圖2)。

2.4T6SS基因簇在空腸彎曲菌菌株中的分布 通過對空腸彎曲菌菌株的T6SS基因簇9種主要基因的存在/缺失的綜合分析，結(jié)果表明，有36.5%(19/52)的菌株含有T6SS基因簇，且所有菌株中的T6SS基因簇的結(jié)構(gòu)完整，這些菌株只分布在Clade 5和Clade 6兩個分支中(圖3)。

圖1 空腸彎曲菌基于基因組SNP的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of Campylobacter jejuni based on SNP

圖2 3種細菌T6SS基因簇結(jié)構(gòu)Fig.2 T6SS gene cluster structure of three bacteria species

圖3 T6SS基因簇在空腸彎曲菌菌株中的分布Fig.3 Distribution of T6SS in the population of Campylobacter jejuni

3 討 論

隨著第二代測序技術(shù)的廣泛使用，基于基因組數(shù)據(jù)的遺傳分析和種群分析越來越多應(yīng)用于病原微生物領(lǐng)域，截止2019年1月份，公共數(shù)據(jù)庫中(如NCBI、Patric和pubMLST databases等)全基因組測序數(shù)據(jù)彎曲菌數(shù)量已經(jīng)超過24 000株。本研究通過分析本實驗室測定的中國空腸彎曲菌菌株和國際已發(fā)表的空腸彎曲菌的基因組數(shù)據(jù)，通過系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建獲得空腸彎曲菌的菌株分群，并對空腸彎曲菌的T6SS基因簇結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在空腸彎曲菌種內(nèi)T6SS基因簇結(jié)構(gòu)保守，基因的排列和組成非常穩(wěn)定，而與其他彎曲菌種(簡明彎曲菌)和同為ε變形菌門的螺桿菌屬(雞螺桿菌)菌的T6SS基因簇進行比較，發(fā)現(xiàn)不同種之間T6SS基因簇的基因排列組合多樣化，但均包括hcp等9種主要功能基因，保證T6SS功能的完整性。

T6SS與細菌的致病性、競爭優(yōu)勢和對環(huán)境擾動的適應(yīng)能力密切相關(guān)。對空腸彎曲菌T6SS的研究表明，T6SS失活導(dǎo)致對細胞的粘附和侵襲減少，并且T6SS缺陷型空腸彎曲菌不能有效地建立持續(xù)定植[17, 24]，而T6SS標志蛋白溶血素共調(diào)節(jié)蛋白(Hcp)的高表達則顯著增強了這一過程。在不同的應(yīng)激條件下，T6SS也與細菌的生長、運動和存活有關(guān)[25]。盡管有研究表明攜帶T6SS的菌株可能與選擇性的靶向蛋白菌為共生體，以促進其在定植中競爭優(yōu)勢，但T6SS的作用和功能仍有待闡明[26]。

本研究首次分析中國空腸彎曲菌攜帶的T6SS基因簇的結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，在雞來源菌株的分支內(nèi)(Clade 2和Clade 6中國菌株有83.3%(10/12)攜帶T6SS基因簇，其可能與中國菌株的生態(tài)位顯著相關(guān)。

基于T6SS基因簇的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示雞源菌株高度集中分布在同一個進化分支中，提示含有T6SS的空腸彎曲菌在雞腸道中定植具有優(yōu)勢；而含有T6SS的臨床病人分離菌均存在雞來源菌株的進化分支中，提示這些病人的空腸彎曲菌感染源可能與雞相關(guān)，提示T6SS基因簇分析對于的公共衛(wèi)生中的病原菌溯源有重要意義。

利益沖突：無