伍玲麗，楊玉蓉，張 麗，劉小紅，司友斌

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，農(nóng)田生態(tài)保育與污染防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥230036）

納米銀（AgNP）與傳統(tǒng)的銀顆粒相比具有耐高溫、電導(dǎo)率高和電阻率相對(duì)較低等理化性質(zhì)以及抗菌特性，因此在食品包裝、個(gè)人護(hù)理品和其他產(chǎn)品中得到了廣泛的應(yīng)用[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球?qū)gNP 的消費(fèi)高達(dá)5.5～550 t·a-1[3]。然而，AgNP 的廣泛使用增加了其釋放到環(huán)境中的風(fēng)險(xiǎn)，環(huán)境中的AgNP 顆粒通過大氣沉降、污水灌溉、垃圾填埋等方式最終匯集于土壤，預(yù)測AgNP在土壤中每年可增加1.2～2.3 ng·kg-1[4]。美國EPA 調(diào)查推測，10 年后農(nóng)田土壤中AgNP 可累積到10 mg·kg-1[5]。從2013 年開始，AgNP 的環(huán)境毒性引起了廣泛的關(guān)注[6]。研究表明AgNP 對(duì)土壤微生物具有毒害作用[7-9]。

氮循環(huán)是影響陸地生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力可持續(xù)性發(fā)展的重要物質(zhì)循環(huán)[10]。其中，固氮微生物在調(diào)節(jié)土壤氮素轉(zhuǎn)化中起著關(guān)鍵作用。生物固氮是陸地及其他環(huán)境中氮素最主要的天然來源[11]，生態(tài)系統(tǒng)中絕大多數(shù)生物可利用形式的氮主要來源于土壤固氮微生物群落（如藍(lán)細(xì)菌、假單胞菌、固氮螺菌和固氮菌）的生物固氮作用[12]。它們通過固氮酶將大氣N2轉(zhuǎn)化為植物有效氮，從而為生態(tài)系統(tǒng)提供額外的氮源[13]。其中nifH基因編碼的固氮酶普遍存在于固氮微生物中[14]。編碼這種酶的nifH基因在細(xì)菌和古細(xì)菌結(jié)構(gòu)域中高度保守，可為研究固氮菌群落提供依據(jù)，因此已被廣泛用作研究固氮微生物多樣性和豐度的遺傳標(biāo)記物[15]。

AgNP的毒性機(jī)制主要有：與細(xì)胞膜相互作用，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)；造成細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）累積，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷；AgNP或釋放的Ag+穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，破壞DNA復(fù)制等[16-19]。但關(guān)于AgNP釋放的Ag+的毒性大小一直存在爭議。前期研究發(fā)現(xiàn)，AgNP 和Ag+對(duì)土壤中硝化微生物及其氨氧化速率都有負(fù)面影響，但Ag+的影響程度比AgNP 低[20]。有研究表明Ag+的毒性具有即時(shí)性，而AgNP 的毒性具有長期性[21]。目前，關(guān)于AgNP 對(duì)土壤固氮微生物的影響研究較少，尤其是自生固氮作用。自生固氮菌容易受到溫度、水分和養(yǎng)分等環(huán)境因素的影響。此外，重金屬也會(huì)造成固氮菌群數(shù)量的改變[22]。Kumar等[23]發(fā)現(xiàn)AgNP、納米銅（CuNP）、納米硅（SiNP）對(duì)極地土壤微生物均產(chǎn)生毒害作用，其中AgNP 能顯著抑制固氮菌的活性。Arnaout 等[24]研究也證實(shí)AgNP 可擾亂土壤中的氮循環(huán)。釋放到土壤環(huán)境中的AgNP 可能對(duì)土壤固氮產(chǎn)生負(fù)面作用，因此有必要研究AgNP 對(duì)土壤固氮微生物及固氮作用的影響。

本文針對(duì)AgNP 的環(huán)境暴露，利用高通量測序技術(shù)比較了不同濃度10 nm 的AgNP（10、25、50 mg·kg-1）和50 nm 的AgNP（25、50、100 mg·kg-1）暴露對(duì)土壤固氮微生物多樣性及群落組成的影響，并對(duì)AgNP暴露下土壤自生固氮菌數(shù)量以及固氮酶活性進(jìn)行了測定，以期為AgNP 的土壤微生物效應(yīng)及對(duì)氮循環(huán)影響的研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料

10 nm的AgNP購于南京先豐納米有限公司，平均粒徑為10±5 nm，形態(tài)如圖1A所示。50 nm的AgNP購于南京埃瑞普納米材料有限公司，平均粒徑為50±5 nm，形態(tài)如圖1B所示。

圖1 兩種粒徑納米銀透射電鏡圖Figure 1 Transmission electron microscope（TEM）images of AgNP of two sizes

表1 土壤樣品的基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of measured soil

1.1.2 土壤樣品采集及培養(yǎng)

供試土壤為黃褐土，采自安徽省合肥市包河區(qū)大圩鎮(zhèn)（31°46′ N，117°22′ E），采樣深度為0～20 cm。土壤采集后取出其中的植物根和殘葉，過20 目篩備用。土壤理化性質(zhì)的測定參見《土壤農(nóng)化分析》[25]，測定結(jié)果如表1 所示。將新鮮土壤過20 目篩后放置于30 ℃恒溫箱中預(yù)培育7 d。將兩種粒徑的AgNP 與少量風(fēng)干土混合后再與培育后的約100 g 鮮土混合均勻，土壤中10 nm 的AgNP（nAg10）終濃度為10、25、50 mg·kg-1，50 nm 的AgNP（nAg50）終濃度為25、50、100 mg·kg-1。將混合后的土壤樣品放于30 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)，調(diào)節(jié)土壤含水量至田間最大持水量的60%，定時(shí)取樣，每組3個(gè)重復(fù)。

1.2 AgNP對(duì)土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

1.2.1 土壤樣品前處理

稱取200 mg 兩種粒徑AgNP 最高劑量暴露7 d（nAg10S 和nAg50S）和90 d（nAg10L 和nAg50L）的土壤，將其放入滅菌后的2 mL 離心管中，并加入1 mL 70%的乙醇，混合均勻后高速（10 000 r·min-1）離心3 min，去除上清液。加入磷酸緩沖液（PBS），以相同的轉(zhuǎn)速離心3 min 后再倒去上清液。最后將離心管于55 ℃烘10 min，使殘留乙醇完全揮發(fā)。同時(shí)未添加AgNP的土壤作為對(duì)照組（CK）。

1.2.2 土壤DNA的提取及PCR擴(kuò)增

按照E.Z.N.A Mag-Bind Soil DNA（OMEGA）試劑盒進(jìn)行土壤微生物總DNA 的提取，用nifH基因作為特異性引物[15]。定量PCR 反應(yīng)體系為：2×Taq master Mix 15 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，Genomic DNA 10～20 ng，加dd H2O 至30 μL。PCR 擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件見表2。

1.2.3 Illumina Miseq測序及生物信息學(xué)分析

DNA 純化回收和定量混合后利用Illumina Miseq測序平臺(tái)進(jìn)行高通量分析，上機(jī)前保證其終濃度為20 pmol·L-1。測序服務(wù)委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。高通量測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)使用FastQC 進(jìn)行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量序列和嵌合體序列。OTU（Operational taxonomic units）指人為給每個(gè)分類單元設(shè)置的同一標(biāo)志，通常對(duì)97%相似水平下的OTU 進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析[26]。使用Usearch進(jìn)行OTU 聚類，然后根據(jù)樣本分析所得OTU 情況使用QIIME（Quantitative insights into microbial ecology）中的alpha_diversity分析模塊進(jìn)行Alpha多樣性分析。

1.3 土壤自生固氮細(xì)菌數(shù)量測定

AgNP 處理7、28、60、90 d 后，選擇Ashby 培養(yǎng)基，采用MPN 稀釋法測定土壤自生固氮菌的數(shù)量[27]。培養(yǎng)基成分如下：甘露醇10.0 g，KH2PO40.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，蒸餾水1000 mL，調(diào)節(jié)pH至6.8～7.0。

1.4 土壤固氮活性測定

根據(jù)固氮微生物體內(nèi)的固氮酶可將C2H2還原為C2H4的能力，采用C2H2還原法測定土壤的固氮作用，固氮酶活性由每克干土每小時(shí)乙稀產(chǎn)生的納摩爾數(shù)（nmol·h-1·g-1）來表示[28]。將兩種粒徑AgNP 暴露后的土壤（20 g）放入無菌氣密玻璃瓶中，用葡萄糖調(diào)節(jié)土壤含碳量使其達(dá)到1 mg·g-1，用純C2H2氣體（99.99%）代替10%的瓶內(nèi)空氣（10 mL）。將所有土壤樣品在28 ℃下溫育48 h，并使用氣相色譜（GC-7890B，安捷倫，美國）測定C2H4濃度。檢測器為FID，色譜柱為Agilent 19095P-Q04 HP-plot，毛細(xì)管柱為30 m×0.350 mm×40 μm，檢測條件為檢測器溫度150 ℃，柱溫40 ℃，進(jìn)樣溫度150 ℃，載氣為N2，燃?xì)鉃镠2，空氣流速為400 mL·min-1。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并對(duì)不同處理間的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比較進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)，Origin 9.0和R語言程序包（Venn 圖采用VennDiagram 軟件包，熱圖采用pheatmap軟件包）作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AgNP 暴露下土壤固氮微生物OTU 數(shù)量及Venn圖分析

AgNP 暴露下土壤固氮微生物OTU 數(shù)量變化如圖2A 所示，未添加AgNP 的土壤固氮微生物的OTU數(shù)目最多，所含的微生物種類最豐富，兩種粒徑不同濃度AgNP 暴露下土壤固氮微生物數(shù)量均有所下降。圖2B 中CK 組土壤特有OTU 的數(shù)目為2166，nAg10S、nAg10L、nAg50S 和nAg50L 各處理組的土壤獨(dú)有OTU數(shù)目分別為683、768、784 和1144。10 nm 和50 nm 的AgNP 暴露7 d 和90 d 后土壤固氮微生物OTU 數(shù)量差異不顯著。

表2 PCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件Table 2 PCR amplification primers and reaction conditions

2.2 AgNP 暴露下土壤固氮微生物的主要組成及豐度變化

熱圖根據(jù)顏色的深度來定義群落分布豐度，結(jié)果更直觀，更清晰。屬水平上豐度前10 的物種熱圖分析見圖3。橫向是固氮微生物根據(jù)進(jìn)化關(guān)系的聚類分支，其中CK 組獨(dú)為一類，將nAg50S 組和nAg50L 組先歸并，再與nAg10L 組聚合為另一類，繼而又與nAg10S 組歸并。CK 組土壤樣品微生物群落結(jié)構(gòu)與nAg10S、nAg10L、nAg50S 和nAg50L 組差異較大。另外，從圖中可以看到，CK組土壤相對(duì)豐度最高的菌屬依次為慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、流行桿菌屬（Vulgatibacter）和厭氧黏細(xì)菌屬（Anaeromyxobacter）。AgNP 暴露后這些微生物的豐度明顯降低，而固氮弧菌屬（Azoarcus）的豐度卻大幅上升，與CK 組差別較大，說明AgNP 的暴露引起了固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的改變。

圖2 納米銀暴露下土壤微生物OTU數(shù)量分布圖及OTU的Venn圖分析Figure 2 Quantitative distribution of soil microbial OTU and Venn diagram representation of the OTU under the exposure of AgNP

圖3 納米銀暴露下土壤固氮微生物物種豐度熱圖Figure 3 Heat map of soil nitrogen fixing microbial species abundance under the exposure of AgNP

2.3 AgNP暴露下土壤固氮微生物多樣性分析

納米銀對(duì)土壤固氮微生物多樣性的影響見表3。Chao 指數(shù)和Ace 指數(shù)常用來分析微生物群落的豐富程度。Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)用來估算樣品中微生物的多樣性，其中Shannon 值越大，說明這個(gè)群落的多樣性越高，而Simpson值則相反。Coverage指樣本庫的覆蓋水平[12]。從表3中可以發(fā)現(xiàn)，CK組的土壤固氮微生物的多樣性最高，其次是nAg50L 組和nAg10L組，nAg10S 組的土壤固氮微生物多樣性最低，這與各處理的OTU 數(shù)目比較分析結(jié)果相似，說明AgNP 改變了土壤固氮微生物群落，造成其多樣性下降。

表3 納米銀對(duì)土壤固氮微生物多樣性的影響Table 3 Effects of AgNP on nitrogen-fixing microbial community diversity

2.4 AgNP對(duì)土壤自生固氮菌數(shù)量的影響

兩種粒徑的AgNP暴露下土壤自生固氮菌數(shù)量變化如圖4 所示。nAg10（10、25、50 mg·kg-1）暴露28 d后，土壤自生固氮菌數(shù)量減少了18.96%～47.28%；nAg50（25、50、100 mg·kg-1）暴露28 d后土壤自生固氮菌數(shù)量減少了17.42%～27.78%；兩種粒徑AgNP 暴露90 d 后，土壤自生固氮菌數(shù)量總體上分別下降了29.51%～51.04%和20.83%～24.47%。隨著暴露時(shí)間的延長，AgNP 對(duì)土壤自生固氮菌數(shù)量影響減輕，且nAg10 對(duì)土壤固氮菌表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗菌活性，說明AgNP對(duì)自生固氮菌的影響與其暴露時(shí)間和尺寸有關(guān)。

2.5 AgNP對(duì)土壤固氮酶活性的影響

從圖5 可以看出，CK 組土壤固氮酶活性最高，AgNP 暴露下土壤固氮酶活性均受到不同程度的影響，尤其是培養(yǎng)后期，土壤固氮酶活性明顯降低。nAg10（50 mg·kg-1）和nAg50（100 mg·kg-1）暴露28 d后土壤固氮酶活性分別降低8.54%和6.76%。隨著AgNP 暴露時(shí)間的延長，土壤固氮酶活性繼續(xù)降低。第90 d 時(shí)，與CK 組相比，nAg10（10、25、50 mg·kg-1）處理組土壤固氮酶活性下降了14.55%～27.47%，nAg50（25、50、100 mg·kg-1）處理組土壤固氮酶活性降低了17.87%～21.79%。

圖4 兩種粒徑納米銀暴露下土壤自生固氮菌數(shù)量Figure 4 Variation of azotobacter number under two sizes of AgNP exposure

圖5 兩種粒徑納米銀暴露下土壤固氮酶活性變化Figure 5 Variation of soil nitrogenase activites under two sizes of AgNP exposure

3 討論

土壤微生物在維持土壤功能方面發(fā)揮著重要作用，如分解有機(jī)物和將無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮等[29]。自然生態(tài)系統(tǒng)和傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的氮循環(huán)主要依賴于固氮微生物的生物固氮作用，因此確定AgNP 對(duì)土壤微生物及其功能的影響尤為重要。本研究基于固氮微生物功能基因nifH的高通量測序分析結(jié)果，表明AgNP 暴露導(dǎo)致土壤固氮微生物數(shù)量和OTU 數(shù)量降低，改變固氮微生物的群落結(jié)構(gòu)。沒有添加AgNP 的土壤中Bradyrhizobium為優(yōu)勢菌屬，其相對(duì)豐度也較高。而AgNP 暴露后Azoarcus變?yōu)閮?yōu)勢菌屬，且其相對(duì)豐度明顯高于其他菌群。Chunjaturas 等[30]也發(fā)現(xiàn)AgNP暴露會(huì)改變土壤微生物群落組成。Ge等[31]同樣發(fā)現(xiàn)不同劑量納米二氧化鈦（TiO2NP）和納米氧化鋅（ZnONP）暴露均改變了土壤微生物群落構(gòu)成，且群落多樣性及土壤中微生物數(shù)量均減少。

固氮細(xì)菌對(duì)環(huán)境因素變化極其敏感，在兩種粒徑AgNP 短期暴露下土壤自生固氮菌數(shù)量下降非常明顯。另外，隨著AgNP 暴露時(shí)間的延長，各處理組自生固氮菌數(shù)量下降趨勢變緩。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于AgNP 添加到土壤后，隨著其暴露時(shí)間的延長，激發(fā)了微生物體內(nèi)的自我保護(hù)機(jī)制，如產(chǎn)生細(xì)胞胞外蛋白質(zhì)或多糖等物質(zhì)來緩解AgNP 的毒性；另外也可能是AgNP 進(jìn)入土壤后與有機(jī)物、黏土礦物等物質(zhì)相互作用，使得AgNP 發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象且釋放的Ag+減少，影響了其毒性[32]。除此之外，由于土壤氧化還原電位等因素還會(huì)促使一部分AgNP 顆粒形成銀的硫化物[33]，使其毒性降低。也有研究表明，土壤中AgNP轉(zhuǎn)化的Ag2S 具有生物可利用性，能在不同的生物體中引起毒性效應(yīng)[34]。

乙炔還原試驗(yàn)結(jié)果表明AgNP 抑制土壤固氮酶活性，但主要發(fā)生在AgNP 的暴露后期，這可能是因?yàn)橥寥拦痰饔檬且粋€(gè)緩慢的過程[35]。Grün 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，0.01～1 mg·kg-1AgNP 暴露一年后對(duì)土壤微生物量、固氮微生物豐度、酶活性和功能基因表達(dá)具有負(fù)面作用，影響土壤氮循壞。孫影等[36]研究了不同劑量TiO2NP 暴露下對(duì)不同類型土壤中氮轉(zhuǎn)化相關(guān)細(xì)菌活性的影響，發(fā)現(xiàn)其抑制了土壤自生固氮菌的活性。本研究發(fā)現(xiàn)AgNP 造成土壤固氮作用下降，這一方面可能由于AgNP 釋放的Ag+的作用，另一方面可能是因?yàn)锳gNP 自身影響了土壤中的固氮微生物活性從而影響固氮作用。AgNP進(jìn)入土壤后會(huì)釋放出一定量的Ag+，Ag+與土壤微生物作用而影響酶的活性[37]。同劑量AgNP 和Ag+處理下，AgNP 對(duì)土壤硝化作用的抑制效果更顯著[23]。另外，Ag+對(duì)土壤微生物及酶活性在短期內(nèi)作用效果明顯，而AgNP 對(duì)土壤微生物的毒性發(fā)生在暴露后期，其毒性更具持久性[38]，AgNP 的毒性部分來自釋放的Ag+，部分由于本身的特異抗菌性。前期實(shí)驗(yàn)室模擬培養(yǎng)條件下發(fā)現(xiàn)小粒徑的AgNP 對(duì)固氮菌具有更強(qiáng)的抑制作用[39]，但在土壤環(huán)境中兩種粒徑AgNP 對(duì)土壤固氮微生物的毒性無顯著差異，這可能是由于土壤系統(tǒng)比實(shí)驗(yàn)室模擬環(huán)境復(fù)雜，其緩沖作用較強(qiáng)。

雖然本研究發(fā)現(xiàn)AgNP 暴露下土壤固氮微生物的種類減少，多樣性及豐度降低，群落組成發(fā)生明顯變化，土壤自生固氮菌數(shù)量和土壤固氮酶活性在Ag-NP暴露后均受到不同程度的影響，對(duì)AgNP的土壤環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)具有一定的貢獻(xiàn)。但是關(guān)于AgNP 對(duì)土壤固氮微生物代謝途徑的影響以及與固氮酶的結(jié)合方式等尚不清楚，還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

（1）AgNP 作用下土壤固氮微生物多樣性明顯降低，其群落結(jié)構(gòu)組成也發(fā)生顯著變化。與對(duì)照組相比，50 nm 的AgNP 暴露90 d 土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)差別最小，10 nm 的AgNP 暴露7 d 土壤固氮微生物群落變化最大。

（2）兩種粒徑AgNP 暴露后土壤自生固氮菌數(shù)量均下降，但隨著AgNP 暴露時(shí)間的延長，下降趨勢變緩。

（3）土壤固氮酶活性隨著AgNP 暴露時(shí)間的延長而降低，AgNP暴露后期對(duì)土壤固氮酶活性影響較大。AgNP的抑制作用與其粒徑、濃度以及暴露時(shí)間有關(guān)。