徐振雷，張正衛(wèi)

肺癌是惡性程度很高的腫瘤，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌的80%，由于早期癥狀不明顯，約75%的NSCLC患者被確診時(shí)有局部轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1-4]，預(yù)后不容樂觀，因此尋找新的診斷和治療標(biāo)志物迫在眉睫。

金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一類相對分子量低(6 000～7 000 Da)、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白，之前有研究報(bào)道其與細(xì)胞的金屬的代謝有關(guān)，并且可以保護(hù)細(xì)胞免受親電性致癌物的攻擊[5]。越來越多的研究報(bào)道MT家族在包括腫瘤在內(nèi)的病理過程中起到重要調(diào)節(jié)作用，MT被許多研究團(tuán)隊(duì)證明在肝癌中低表達(dá)[6]，金屬硫蛋白1M(metallothio-nein 1M，MT1M)屬于MT家族的一員，有報(bào)道MT1M抑制了肝癌的發(fā)生發(fā)展[7-9]，MT1M啟動子甲基化是乳腺癌和肝癌的生物標(biāo)志物[10-11]，提示MT1M與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但是MT1M在NSCLC中的表達(dá)及生物學(xué)效應(yīng)尚不完全清楚，本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測MT1M在NSCLC組織中的表達(dá)并分析其與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系，并且在體外細(xì)胞功能層面研究MT1M與腫瘤侵襲和遷移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料 組織芯片購于上海芯超有限公司，包含144對NSCLC組織及對應(yīng)癌旁組織的組織芯片以及完整的臨床病理資料，患者術(shù)前均未經(jīng)放射治療和化學(xué)治療。

1.2 主要儀器與試劑 GTVisionTM抗兔鼠通用型免疫組織化學(xué)試劑盒購自于上海研卉生物有限公司，鼠抗人MT1M抗體、GAPDH單抗、FLAG抗體和兔抗鼠二抗購自于美國西格瑪公司。人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、H520和H1650細(xì)胞株，過表達(dá)MT1M質(zhì)粒為PCDH-Lenti-MT1M flag(lenti-MT1M)，2個(gè)敲減MT1M質(zhì)粒為pSIREN-RetroQ-sh-MT1M-1(shMT1M-1)和pSIREN-RetroQ-sh-MT1M-2(shMT1M-2)購自于上海中科院研究所。Transwell侵襲和遷移試劑盒購自于美國康寧公司。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測 將組織芯片放置于二甲苯中脫蠟，并在梯度乙醇中水合，在沸騰的檸檬酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)15 min，冷卻至室溫。為了阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，將芯片浸入0.3%過氧化氫磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液中10 min，然后在PBS中充分沖洗。將芯片與MT1M的一抗(1∶100稀釋)一起孵育4 ℃過夜。用PBS洗滌后，使用二抗在37 ℃孵育30 min，使用PBS代替一抗作為陰性對照，使用奧林巴斯顯微鏡和軟件成像系統(tǒng)捕獲芯片圖像。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 將組織芯片在光鏡下觀察和評分[12]，同時(shí)進(jìn)行病理圖像采集。MT1M主要定位在細(xì)胞質(zhì)，綜合低倍鏡下染色強(qiáng)度和高倍鏡下陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行半定量測定，為了減少誤差，隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行判讀。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：基本不著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。陽性細(xì)胞數(shù)百分比評分標(biāo)準(zhǔn)：計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<10%為0分；10%～40%為1分；41%～70%為2分；>70%為3分。兩者相加后若為0～2分為陰性；2～6分為陽性。結(jié)果由2名有資質(zhì)的病理科醫(yī)師進(jìn)行判讀，陰陽性判斷不一致時(shí)，以第3位病理科醫(yī)師的判讀結(jié)果為準(zhǔn)。

1.5 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建 在6孔板內(nèi)加入適量細(xì)胞，使細(xì)胞密度24 h后達(dá)到50%，使用10%培養(yǎng)基與病毒感染液1:1混合后培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)液，加入1∶2 000嘌呤霉素培養(yǎng)基，篩選出陽性細(xì)胞，細(xì)胞傳代至第三代，收集細(xì)胞用免疫印跡法檢測過表達(dá)和敲減效率。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移和侵襲 調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL，取200 μL細(xì)胞株各約1×105左右的細(xì)胞懸勻后鋪在上層小室里，下層小室加600 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，孵育24 h，吸去上層小室培養(yǎng)液，用PBS清洗2次，用棉簽小心刮除小室上方的細(xì)胞，反面的細(xì)胞用PBS清洗后，用甲醇固定30 min，0.2%的結(jié)晶紫染色20 min，PBS清洗后，在高倍鏡下(×400)用光鏡拍照，每個(gè)小室取5個(gè)視野，重復(fù)3次，計(jì)算3次均數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法，以P<0.05為差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MT1M在NSCLC組織中的表達(dá)及其與患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 通過檢測144對NSCLC組織及其癌旁組織中MT1M的表達(dá)，腫瘤組織中MT1M陽性率為20.14%，癌旁組織中MT1M陽性率為90.28%，腫瘤組織及其癌旁組織之間MT1M陽性表達(dá)率差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=143.23，P<0.01)。腫瘤組織中MT1M表達(dá)低于對應(yīng)癌旁組織。典型免疫組織化學(xué)結(jié)果見圖1。腫瘤組織中MT1M的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(χ2分別為18.66、12.73，P均<0.01)，而與性別、年齡、腫瘤直徑及分化程度無關(guān)(χ2分別為0.001、1.91、0.10、1.80，P均>0.05)，見表1。

MT1M主要定位于細(xì)胞質(zhì)中；A、B為癌旁組織中MT1M高表達(dá)；C、D為腫瘤組織中MT1M低表達(dá)圖1 MT1M在NSCLC組織及其癌旁組織中的表達(dá)

表1 MT1M表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.2 MT1M對NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 通過免疫印跡法檢測NSCLC細(xì)胞系中MT1M的表達(dá)，A549細(xì)胞和H520細(xì)胞中MT1M表達(dá)較正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B低，而H1650細(xì)胞中MT1M表達(dá)高(F=91.21，P<0.01)，圖2A。選取A549細(xì)胞和H1650細(xì)胞用于細(xì)胞遷移和侵襲功能實(shí)驗(yàn)，在A549細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)MT1M，在H1650細(xì)胞中穩(wěn)定敲減MT1M，采用免疫印跡法驗(yàn)證不同穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中MT1M的表達(dá)情況，結(jié)果見圖2B、圖2C。Transwell實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，過表達(dá)MT1M后A549遷移和侵襲能力明顯降低(t分別為14.08、9.177，P均<0.001)，敲減MT1M(選擇敲減細(xì)胞株shMT1M-2)后H1650遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)(F分別為50.46、48.09，P均<0.001)。

2.3 NSCLC組織中MT1M的表達(dá)與患者預(yù)后間的關(guān)系 生存分析結(jié)果表明，對于TNMⅠ、Ⅱ和Ⅲ期的NSCLC患者，MT1M陽性患者的總體生存期高于MT1M陰性患者(見圖4A～圖4C)，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-Rank檢驗(yàn)，χ2分別為21.19、10.13、6.10，P均<0.05)。此外，多因素Cox回歸分析顯示，NSCLC組織中MT1M的表達(dá)是NSCLC患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.001，見表2)。

A.采用免疫印跡法檢測正常上皮細(xì)胞BEAS-2B和NSCLC細(xì)胞系中MT1M的表達(dá)；B.在A549細(xì)胞中使用慢病毒(lentivirus)穩(wěn)定過表達(dá)MT1M，獲得過表達(dá)細(xì)胞株P(guān)CDH-Lenti-MT1M flag(Lenti-MT1M)；C.在H1650中使用shRNA敲減MT1M，獲得敲減細(xì)胞株pSIREN-RetroQ-sh-MT1M-1(shMT1M-1)和pSIREN-RetroQ-sh-MT1M-2(shMT1M-2)，選擇GAPDH作為內(nèi)參，**P<0.01，***P<0.001圖2 免疫印跡法檢測NSCLC細(xì)胞系中MT1M表達(dá)

A.過表達(dá)MT1M后A549細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著降低；B.敲減MT1M后H1650細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)分析NSCLC細(xì)胞株A549和H1650的遷移和侵襲

MT1M陽性與MT1M陰性NSCLC患者比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，NS：無差異A.TNM Ⅰ期(48例)；B.TNM Ⅱ期(48例)；C.TNM Ⅲ期(45例)；D.TNM Ⅳ期(3例)圖4 NSCLC患者M(jìn)T1M表達(dá)與預(yù)后關(guān)系的Kaplan-Meier生存曲線

表2 NSCLC患者預(yù)后因素的單因素和多因素方差分析

3 討論

以往有研究報(bào)道，MT1M在肝癌組織中低表達(dá)，并且可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[7-8,13]，MT1M表達(dá)較低的肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯升高，預(yù)后往往不容樂觀[9]，同時(shí)MT1M啟動子甲基化狀態(tài)可以作為肝癌血清診斷的標(biāo)志物[11]，表明MT1M對肝癌的發(fā)生發(fā)展起到重要作用。本研究結(jié)果顯示，MT1M在NSCLC組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，表明其低表達(dá)可能導(dǎo)致NSCLC組織上皮過度增殖或突變，進(jìn)而形成腫瘤。

通常腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，首先要在原發(fā)灶侵襲基底膜，然后進(jìn)入血管或淋巴結(jié)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是否發(fā)生轉(zhuǎn)移對患者的預(yù)后影響十分重要[14-15]。MT1M與患者臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)MT1M與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，患者越趨于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，組織中MT1M表達(dá)越低。體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)顯示MT1M在NSCLC中可能具有抑制癌細(xì)胞遷移的功能。此外，生存分析結(jié)果顯示，對于TNMⅠ、Ⅱ和Ⅲ期的NSCLC患者，MT1M陰性的NSCLC患者總體生存期較MT1M陽性患者明顯縮短，多因素方差分析顯示NSCLC組織中MT1M的低表達(dá)是患者總體生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示MT1M在NSCLC中可以作為預(yù)后標(biāo)志物，其低表達(dá)提示NSCLC患者預(yù)后不良。

本研究初步探討了MT1M可能具有抑制NSCLC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的功能，其表達(dá)也可作為NSCLC患者潛在的預(yù)后標(biāo)志物，但具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。